绿色工艺制备聚乙烯亚胺衍生物在细胞支架和介导基因转染中的研究-生物医学工程专业论文.docxVIP

绿色工艺制备聚乙烯亚胺衍生物在细胞支架和介导基因转染中的研究摘要聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)作为典型的阳离子聚合物之 一，已经广泛应用于组织工程支架以及作为基因转染的载体。由于 PEI本身血液相容性较差，细胞毒性大等缺点严重制约了其进一步应 用。利用化学方法对PEI分子改性是一种有效降低其细胞毒性和改善 血液相容性的方法。生物材料通过静电纺丝技术制备的具有极大比表 面积的纳米纤维可以很好地模拟天然细胞外基质，为细胞的粘附、增 殖及为生理功能提供良好的微环境。本论文结合两性离子化合物良好的生物相容性优势，设计合成两 性离子化合物PEI衍生物。利用高压静电纺丝技术制备PEI-C/聚乙烯 醇(polyvinylalcohol,PVA)的低毒复合纳米纤维，考察其纤维性能和 细胞毒性；研究改性后的PEI(PEI-C)作为基因载体时在水溶液中与质 粒DNA(Plasmiddeoxyribonucleicacid, pDNA)之间的相互作用、纳米 复合物的形成、载体的生物相容性、细胞毒性及基因复合物在体外的 转染等性能。本论文的研究内容主要分为以下几个方面：（1）利用绿色化学的理念，基于富氨基类聚合物对二氧化碳有 很强的吸附性这一特点，结合两性离子化合物良好的生物相容性的优 势，用二氧化碳对超支化PEI25KDa进行改性，制备出聚乙烯亚胺衍V生物(PEI-C)。通过核磁（NMR）、元素含量检测和傅氏转换红外线光谱分析仪（FT-IR）对所制备的衍生物进行表征确认其结构。考察 二氧化碳吸收时间、PEI反应浓度等影响因素，结果表明：PEI浓度 控制在20%~40%之间；当二氧化碳在通入0.5h 后，PEI中氧元素含 量已达到27%。MTT细胞毒性实验表明，与未修饰的PEI25K相比， PEI-C材料的细胞的相对存活率维持在80%左右；而PEI的细胞毒性 随其浓度增加，细胞存活率从80%左右降低到30%以下，表明PEI-C 的细胞毒性显著降低。（2）采用静电纺丝手段，将PEI-C和PVA制备成具有良好纤维 形貌的含不同比例的PEI-C/PVA复合纳米纤维，用戊二醛蒸汽交联得 到水稳定的纳米纤维膜。扫描电子显微镜（SEM）、FT-IR等手段表 征其纤维膜交联前后的形貌及结构变化。通过对纺丝液浓度、电压、 接收距离和流速等条件的优化，得到了具有良好纤维形貌的含不同比 例的PEI-C/PVA 复合纳米纤维支架。以雪旺细胞（schwanncell）为 模型细胞来研究该材料的生物相容性。研究表明，雪旺细胞在 PEI-C/PVA复合纤维支架表面分布相比未改性的PEI/PVA复合纤维 基质更为密集，细胞形态明显较好，更利于细胞生长；MTT细胞毒 性实验进一步表明，PEI-C/PVA在质量比为35：65 时，纤维支架细 胞的OD 值为0.47，相当于同等条件下PEI/PVA纤维支架OD值的2 倍，证实改性后的复合纤维支架的细胞毒性明显降低。（3）将所制备的PEI-C材料用于介导基因转染的研究。蛋白吸 附实验表明二氧化碳修饰后的PEI-C材料抵御蛋白质吸附的能力增VI强；脱氧核糖核酸酶I的防护和释放实验表明，PEI-C载体材料有保护pDNA免受细胞中核酸酶降解并且可以释放pDNA。使用凝胶电泳 仪考察载体与pDNA 的结合能力，采用动态光散射(DLS)和Zeta电位 仪考察载体与pDNA 形成的复合物的粒径和电位。MTT细胞毒性实 验表明，与未修饰的PEI载体基因复合物(pDNA/PEI)相比，PEI-C载 体基因复合物(pDNA/PEI-C)的细胞毒性显著降低；体外转染实验表 明，PEI-C能够有效地介导基因转染。以Hepa1-6细胞和QBC939细 胞为模型细胞，在有血清情况下，PEI-C作为载体时在Hepa1-6细胞 和QBC939细胞的转染率为33%以上达到甚至高于PEI25KDa作为 载体时的转染效率。随着N/P的增加，转染效率从33%左右增长到 62%左右；在无血清情况下转染，其PEI-C作为载体在两种癌细胞的 转染效率也维持在20%以上，比PEI25KDa作为载体时的转染效率 高2.5倍左右，激光共聚焦图片也与其吻合。实验结果表明PEI-C能 够有效地介导基因转染。关键词：聚乙烯亚胺改性；复合纳米纤维；细胞支架；基因载体； 转染VIIGreenprocessofpreparationofpolyethyleneiminederivativesresearchincellscaffoldandmediatedgenetransfectionABSTRACTPolyethyleneimine(PEI) as oneofthemost typicalcationicpolymer,hasbeenwidelyused intissu