乙酰化修饰调控代谢网络和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的机制的研究-生物化学与分子生物学专业论文.docx

复旦大学博士学位论文乙酰化修饰调控代谢网络和PEPCKl的机制的研究摘要蛋白质的乙酰化作为一种关键的蛋白翻译后修饰越来越受到人们的广泛关注，但是此前的研究大多集中在以组蛋白和核内转录因子为底物的乙酰化研究，我们运用质谱的方法，以人肝组织的细胞质为样品，对乙酰化底物蛋白进行蛋白组学水平的扫描，发现了一系列代谢酶被乙酰化修饰，揭示乙酰化修饰与各种代谢途径关系密切。为了进一步确定乙酰化修饰对代谢途径的调控作用，我们选取了磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCKl)为研究对象进行了深入研究。PEPCKl是调节糖异生的关键酶，PEPCKl催化的步骤是糖异生途径的第一步且这个反应不可逆。我们通过实验发现：一．PEPCKl可以被乙酰化修饰且受到细胞内能量的调控。PEPCKl乙酰化后能进一步促进其泛素化降解，导致PEPCKl蛋白量的减少。细胞通过调节糖异生关键酶PEPCKl的乙酰化从而调控细胞自身对高浓度葡萄糖的响应。相反，当细胞处于低糖浓度时，PEPCKl乙酰化降低，蛋白稳定性增加，PEPCKl执行糖异生的功能。二．我们通过串联亲和纯化的方法鉴定了一系列和PEPCKl相互结合的蛋白，其中UBR5是一个具有HECT(Homologoustothe_E6·APCarboxyl王erminus)结构域的泛素化连接酶(E3 ligase)，实验证明，UBR5的缺失可以导致PEPCKl蛋白量的上升，UBR5可以和PEPCKl相互结合，并且两者之间的结合受到细胞内糖浓度的调控。这些结果都证明了UBR5是导致PEPCKl泛素化降解的E3连接酶。三．我们进一步寻找PEPCKl的乙酰化酶和去乙酰化酶，实验发现，P300是PEPCKl的乙酰化酶，并能增)JIPEPCKl和UBR5的结合，促进其降解；而Si屹是PEPCKl的去乙酰化酶，并减少PEPCKl和UBR5的结合，使其稳定。四．我们通过测定细胞内糖浓度和小鼠血糖的实验来阐述细胞PEPCKl的乙酰化或者泛素化水平对其糖异生功能的影响。实验证明，Sjn2的缺失能够影响细胞内葡萄糖的浓度；相应的结果也能通过敲落UBR5，P300得到；另一方面，从小鼠尾静脉注射针对Sift2敲落的寡核苷酸，结果发现，跟对照组相比，小鼠血糖明显降低。五．我们试图探讨细胞内的营养物质是通过何种途径来影响PEPCKl的乙酰化。实验发现，在高糖浓度下，P300的mRNA水平上升，PEPCKl和P300的结合也随之增加；而在低糖浓度下，Sirt2的mRNA水平上升，PEPCKl被去乙酰化。最后我们总结得出如下的模型：在高糖浓度下，PEPCKl和P300的结合增复旦大学博士学位论文乙酰化修饰调控代谢网络和PEPCKl的机制的研究加，PEPCKl被乙酰化，随后发生泛素化修饰并降解；而在低糖浓度下，Sirt2I拘mRNA含量会上升，PEPCKl去乙酰化，蛋白稳定性上升，发挥糖异生的作用。本文首次报导了代谢酶的翻译后修饰之间的交互作用，PEPCKl乙酰化促进其泛素化降解调控细胞对葡萄糖的响应。PEPCKl含量的上升是二型糖尿病的重要标志物，所以该研究为治疗糖尿病提供了潜在的药物靶点。关键词：乙酰化泛素化磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶糖异生中图分类号：02．91复旦大学博士学位论文乙酰化修饰调控代谢网络和PEPCKI的机制的研究AbstractProteinlysineacetylationhasemergedasakeyposttranslationalmodificationincellularregulation，inparticularthroughthemodificationofhistonesandnucleartranscriptionregulators．Inthefirstpart，weusetandemliquidchromatography—tandemmassspectrometry(LC／LC—MS／MS)toanalysetheaffinity-purifiedacety’latedpeptidesfrOmcytoplasmicfractionofhumanlivertissuesandfoundthatlysineacetylationisaprevalentmodificationinenzymesthatcatalyzeintermediatemetabolism．Virtuallyeveryenzymeinglycolysis，gIucOneOgenesis，thetricarboxylicacid(TCA)cycle，theureacycle．fattyacidmetabolism，and glycogenmetabolismwasfoundtobeacetylatedinhumanlivertissue．Ourstudy