专题5课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段39ppt.ppt

* 课题2　多聚酶链式反应扩增DNA片段 一、PCR的原理及反应过程 1.生物体内DNA复制的条件: (1)原料:______________。 (2)模板:解旋后的每一条________。 (3)酶:打开DNA双链的_______和合成DNA单链的__________。 (4)引物:为DNA聚合酶的起始提供___末端。 4种脱氧核苷酸 DNA母链 解旋酶 DNA聚合酶 3′ 2.PCR的概念和原理: (1)概念:PCR即多聚酶链式反应,是一种体外________________ 的技术。它能以极少量的DNA为模板,在几小时内复制出上百万 份的DNA拷贝。 迅速扩增DNA片段 (2)原理: ①DNA变性:在____________的温度范围内,DNA的_______结构 将解体,双链分开,这个过程称为变性。 ②DNA复性:当温度缓慢降低后,两条彼此分离的DNA链又会重新 ___________,这个过程称为复性。 ③DNA合成:DNA聚合酶从引物____端开始延伸DNA链,DNA的合成 方向总是从子链的____端向____端延伸。 80℃～100℃ 双螺旋 结合成双链 3′ 5′ 3′ (3)条件: ①原料:_______________。 ②模板:热变性解旋后的两条________。 ③酶:________________。 ④引物:能分别与___________两端互补配对的两种引物,为DNA 聚合酶提供3′末端。 ⑤其他条件:需要稳定的_________和能自动调节温度的温控设 备。 四种脱氧核苷酸 DNA母链 耐热的DNA聚合酶 两条模板链 缓冲溶液 3.PCR的反应过程: 变性:当温度上升到___℃以上时,双链DNA解旋,氢键断裂,变为 单链 　 复性:当温度下降到___℃左右,两种引物通过_____________ 分别与两条单链DNA结合 　 延伸:当温度上升到___℃左右,溶液中的四种脱氧核苷酸 (A,T,G,C)在__________的作用下,根据_____________ 原则合成新的DNA链 90 50 碱基互补配对 72 DNA聚合酶 碱基互补配对 二、PCR的实验操作 1.实验用具: (1)PCR仪:该仪器能自动调控_____,实现DNA的扩增。如果没有 PCR仪,可用3个_____水浴锅代替,操作时按程序在3个水浴锅中 来回转移PCR反应的微量离心管。 (2)微量离心管:总容积为____mL,实际上是进行PCR反应的场 所。 (3)微量移液器:用于向微量离心管中转移PCR配方中的液体,每 吸取一种试剂后其上的一次性吸液枪头都必须更换。 温度 恒温 0.5 2.实验步骤: 准备:按照PCR反应需要的物质和条件,将需要的试剂和仪器准 备好 移液:用___________按照配方在微量离心管中依次加入各试剂 混合:盖严离心管口的盖子,用手指轻弹_________,使反应液混 合均匀 离心:将离心管放在离心机上,离心约10s,使反应液集中在 ___________ 反应:将离心管放入______中进行反应 微量移液器 管的侧壁 离心管底部 PCR仪 3.DNA含量的测定: (1)原理:利用DNA在_______的紫外线波段有一强烈的吸收峰。 (2)计算公式: DNA含量(μg/mL)=___________________×稀释倍数。 260 nm 50×(260 nm的读数) 【思考辨析】 1.判断正误 (1)PCR过程中,需要解旋酶打开氢键,使DNA双链解旋为单 链。( ) 【分析】PCR的解旋过程是用热变性的原理打开氢键,未用到 DNA解旋酶。 (2)PCR的引物是一段与DNA相配对的RNA片段。( ) 【分析】PCR的引物可以是RNA片段,也可以是DNA片段。 × × (3)复性过程中,DNA母链与新合成的子链形成双螺旋。( ) 【分析】复性过程是让解旋后的母链通过碱基互补配对与引物 结合。 (4)耐热的DNA聚合酶可以从生活在热泉的细菌中提取。( ) × √ 2.问题思考 (1)PCR反应过程中的温度控制为什么要先高温后低温然后再适当升温?请分析原因。 提示：PCR过程中先高温解旋,后低温使引物与模板结合,然后再适当升温尽量达到TaqDNA聚合酶的最适温度,加快反应速度。 (2)PCR过程中,经过30次循环,一个DNA分子会扩增成多少个? 提示：每循环1次,DNA分子数会变为原来的2倍,因此经过30次循环,会扩增成230个DNA分子。 一、生物体内的DNA复制与PCR反应的比较 严格控制温度变化的温控设备 无 设备 严格配制10倍浓缩扩增缓冲液 不需缓冲液 是否需 缓冲液 体外迅速扩增 边解旋边复制,半保留复