Real time PCR 原理及其定量方法.pptVIP

-dI dT Tm -dI dT Tm 融解曲线单峰图 融解曲线的设置是在PCR反应完成后进行的。一般从60℃升到90℃，得到的融解曲线随着温度的升高，双链DNA的解链，荧光信号不断降低，且在Tm值下降速度最快。用荧光信号强度改变的负的一次导数与温度做图，即得到单峰的融解曲线。峰值代表斜率改变最大值，即为Tm值。 融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光 定量准确 融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确 融解曲线分析可以优化PCR反应条件，可区分单一引物、引物二聚体、变异产物等。 SYBR Green法优缺点 （2）TaqMan探针法 Taqman 荧光探针为一寡聚核苷酸序列，其两端分别标记一个报告基团（荧光发射基团）和一个猝灭基团。探针完整时，发射基团发射的荧光信号被荧光猝灭基团所吸收，无荧光信号被检测。当PCR扩增时，Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可酶切水解探针，使荧光发射基团和淬灭基团分离，荧光共振转移（FRET）效应消失，系统可检测到荧光信号。荧光信号强度与结合探针的DNA量成正比。常用的荧光基团主要有FAM、TET、HEX等。 TaqMan作用机理 探针被Taq酶的5’- 3’ 外切酶活性剪切成片断 游离报告基团发出荧光 在延伸过程中，探针部分与靶序列分离 TaqMan法优缺点 高度特异性 重复性好 灵敏度高 可进行多重PCR定量