微阵列第13次课.pptVIP

第十一章 微阵列数据的系统生物学分析（一） 黄仲曦 基础医学院肿瘤研究所 经典案例 基本分析流程 对脑肿瘤基因芯片数据进行无监督聚类，发现三亚型（神经元型、间充质型和增生型）。间充质型的标签基因149个。 结合ARACNe软件和MRA分析法推断出间充质标签基因的调控网络及6个主要调控因子。 实验证明C/EBP和STAT3是主要调控因子。 背景 恶性胶质瘤是最常见的恶性脑肿瘤，无有效治疗方法。 主要特征是：侵袭性生长和大量血管新生。最近认为这是由于中枢神经系统的神经细胞转化为间充质细胞获得的能力。 先前的基因芯片研究发现过表达间充质标签基因和低表达神经细胞标签基因与恶性胶质瘤的差预后密切相关。 正常的神经组织不会转化为间充质细胞。 间充质细胞样表型是干细胞的特征。 176份恶性胶质瘤基因芯片数据(Affymetrix HU-133A)。聚类分析分为三亚型（神经元型、间充质型和增生型）。间充质型的标签基因149个。 ARACNe软件简介 识别转录因子 Gene Ontology注释为具有转录因子活性。 TRANSFAC数据库记录的转录因子。 去除非特异的转录因子（例如，基本转录复合物）。 总共确认Affymetrix HU-133A芯片有928个转录因子。 ARACNe识别92660个转录相互作用，其中1217个为转录因子与149个间充质标签基因中102个的相互作用。 主要调节因子分析方法MRA 计算每个转录因子的富集分值。即，Fisher’s精确检验计算转录因子的靶基因与间充质标签基因重叠的P值。 计算FDR （Benjamini and Hochberg）。q=p*n/i，其中n为转录因子数量（即928个），i为当前p值的排序。根据q0.05筛选有统计学意义的转录因子（53个）。 根据调控间充质标签基因的数量对转录因子排序。前6位的转录因子分别是：STAT3, C/EBP, bHLH-B2, RUNX1, FOSL2和ZNF238。它们调控74%的间充质标签基因。 Spearman’s相关分析确定STAT3, C/EBP, bHLH-B2, RUNX1和FOSL2为激活物， ZNF238为抑制物。 这6个主要调节因子的靶基因相互重叠，统计学有重要意义。说明这6个转录因子存在共调控的趋势。 三个亚型（神经元型、间充质型和增生型）的主要调节因子基本不重叠。说明不同的亚型恶性胶质细胞瘤受不同的转录因子调控。 逐步线性回归分析法 计算每个间充质标签基因的可能调控因子。Xi为第i个间充质标签基因，fj为第j个调控Xi表达的转录因子。 为了避免过多的多重假设检验校正，只选择下列转录因子：1）由ARACNe软件推断的FDR0.05的53个转录因子；2）其DNA结合位点在间充质标签基因的近端启动子富集而且其在当前芯片数据中的表达变异系数CV≥0.5的转录因子共52个。有6个转录因子在这两组中重复出现，因此总共得到99个转录因子。 MatInspector软件(http://www.genomatix.de)分析转录起始位点上下游各2kb范围内的转录因子结合位点。 转录因子根据它们调节的间充质标签基因的数量进行排序。结果前8位的转录因子包含有MRA推断的6个主要调节因子。其中回归系数最大的三个转录因子是C/EBP (α=0.40), bHLH-B2 (α =0.41) 和STAT3 (α =0.40)，证明它们确实是主要调节因子；第四大的是ZNF238 (α =-0.34)，证明其确实是转录抑制物。 线性回归法与MRA法结果的一致性进一步证明了预测的可靠性。 验证间充质调节模块 为了确定这些转录因子是否结合到预测的靶间充质标签基因的启动子上，在一个人胶质细胞瘤细胞株中进行免疫印迹实验。平均，转录因子特异性抗体（而不是对照抗体）能结合到80%的测试基因组区域。 在胶质瘤细胞中沉默CEBPB, STAT3, bHLH-B2,FOSL2 和RUNX1的表达，然后进行基因芯片分析和GSEA分析发现：每个转录因子沉默后，差异表达基因主要在它们用ARACNe软件推断的靶基因中富集，而不是在对照转录因子的靶基因中富集。而且差异表达基因也在间充质标签基因中富集。 验证C/EBP和STAT3是主要调节因子 在小鼠神经干细胞中过表达这两个转录因子（34次实验）和在人胶质瘤细胞中沉默这两个转录因子的表达（55次实验）。共做89个基因芯片杂交实验。 GSEA分析证实与这两个转录因子共表达的基因分别在它们用ARACNe软件推断的靶基因中富集而对照转录因子则不会。而且共表达基因在间充质标签基因中富集。 C/EBP和STAT3的共同靶基因比各自独有的靶基因更富集间充质标签基因8倍以上（p=2.25×10-5）。 计算混合基因（ CEBPB×STAT3 ），即两个基因mRNA