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分子生物学实验设计报告 绿色荧光蛋白的克隆表达 实验名称 绿色荧光蛋白的克隆表达 实验所属学科 分子生物学实验 实验开展 支撑平台 四川大学江安校区生物实验室 项目组成员基本信息 序号 1 2 姓名/性别 易尧 王远璋 学号 2013141241034 2013141241019 专业年级 2013级 2013级 所在学院 生命科学学院 生命科学学院 引言 荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白。 绿色荧光蛋白是由日本学者下村修于1962年从多管水母中发现并分离得到的一种发光蛋白。它是由238个氨基酸构成的“β-桶”型三维立体结构，其中65至67位氨基酸（丝氨酸-酪氨酸-甘氨酸）形成发光团，为主要的发光位置。 通过生物化学的方法将基因做小小的改变，就可以改变GFP中的氨基酸，得到变异GFP。目前应用较多的GFP的突变体-增强型绿色荧光蛋白（简称EGFP） 传统的PCR产物克隆方法主要有两种：一种是PCR引物设计时引入载体上的酶切位点，PCR产物经双酶切后定向克隆到目的载体上；另一种是TA载体连接。这两种方法费时费力，过程繁冗。 而本实验采用的无缝克隆和组装技术是一种新的、快速、简洁的克隆方法，旨在克服上述缺陷，它可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA的片断的插入，而不需要任何限制性内切酶和连接酶。突破传统的双酶切再加上连接，只需要一步重组法，即可得到高效率克隆的重组载体，这个重组载体能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子。 研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。通过质粒重组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌体内，通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导表达成功。 菌液PCR是直接用菌液作为模板进行PCR的一种选取成功导入载体的菌落的方法，省时，快捷，但容易出现假阳性。为了避免这种情况，我们需在设计引物时加上目的基因片段以及改进菌液处理方法。 二、实验流程 ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ 实验步骤 1.质粒DNA的提取 1.1实验原理： 1.1.1. 质粒：一种染色体外的遗传因子，大小在1kb~200kb之间，是具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制能力，，常常编码一些对宿主有利的酶的基因，包括抗生素、修饰酶等。 1.1.2. 载体：要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，转化到细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体。目前除了大肠杆菌中的质粒、λ噬菌体、M13噬菌体、噬菌粒外，还有酵母人工染色体载体以及动、植物病毒载体等。 1.1.3. 碱变性法抽提质粒DNA：基本原理是根据染色体DNA和质粒DNA分子量的巨大差异而达到分离的。在实验时，我们先分散细胞，通过螯合金属离子使酶失活，并防止DNA的降解。随后细胞在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与染色体DNA发生变性，在酸性条件下质粒DNA复性，同时留在上清液中。而大肠杆菌DNA和蛋白质-SDS复合物等发生沉淀。由此达到分离的效果 1.2实验目的：掌握碱法抽提质粒DNA的原理和方法。 1.3实验材料： 1.3.1材料：含pET- 28a质粒的大肠杆菌，含pEGFP-N3质粒的大肠杆菌 1.3.2试剂： 1）溶液50 mL, 葡萄糖 , 50 mmol/L25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) , 10 mmol/L EDTA (pH 8.0) , 用前加溶菌酶4mg/L.121℃高压灭菌 15 min0~4℃贮存 2）溶液100 mL, 0.2 mol/L NaOH ,SDS, 1% (W/V) 用时由母液2 mol/L NaOH、10%(W/V) SDS稀释现配； 3）溶液100 mL, 60 mL KOAc (5 mol/L), 11.5 mL冰乙酸, 7）液体LB培养基（pH7.0）, 10 g/L胰蛋白胨, 5 g/L酵母提取物 , 10 g/L NaCl , 1 mL/L NaOH(1 mol/L)； 8）氨苄青霉素25mg/mL贮备液 1.3.3仪器设备：恒温水浴锅，高压灭菌锅，超净工作台，移液器，高速离心机，制冰机，漩涡振荡器 1.4实验方法： 1 将含p