质粒DNA的提取纯化及鉴证.docVIP

质粒DNA的提取、纯化及验证 微生物技术2011/10/9 实验目的： 1 掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的作用，掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。 2 掌握质粒DNA的纯化方法，即用酚、氯仿抽提法除去质粒中的蛋白质。 3 学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理，凝胶的制备及电泳方法及凝胶中DNA的分离纯化方法。 实验原理： 本实验采用碱变性法提取质粒DNA，以酚、氯仿及乙醇等试剂纯化质粒DNA，最后采用凝胶电泳对质粒DNA进行分离纯化。 碱变性法提取质粒DNA是最为经典且常用的方法，适用于不同量质粒DNA的提取，操作简单，一般实验室均可进行。提取的质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。碱变性法提取质粒DNA一般包括三个步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但是两者变性与复性所依赖的溶液pH不同。在pH高达12.0的碱性溶液中，染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链由于环状双螺旋结构而无法完全分离。当用pH值4.6的KAc（或NaAc）高盐溶液天劫碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起形成缠联的、可见的白色絮状沉淀，可通过离心分离除去。溶于上清液的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚而形成共沉淀。由于DNA和RNA性质相似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可用RNase A将RNA降解。质粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性的蛋白，可通过酚和氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。 本实验中采用琼脂糖凝胶电泳的方法来检测质粒DNA。电泳是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极方向移动的现象。各种生物大分子在一定pH条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。凝胶是支持电泳介质，它具有分子筛效应。含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，移动的速度可因为电子的大小、形态及电荷量的不同而有差异。利用移动速度差异，就可以区别各种大小不同的分子。因而，凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化DNA片段。琼脂糖是从海藻中提取的长链状多聚物，由β-D-吡喃半乳糖与1,4连接的3,6-脱水-L-吡喃半乳糖组成，相对分子质量为104~105 当琼脂糖加热到90℃左右，即可融化成清亮、透明的液体，浇在模板上冷却后固化成凝胶，其凝固点为40~45℃。琼脂糖的分离范围大，小片段DNA(50~20000bp)最适合在恒定强度和方向的电场中水平方向的琼脂糖凝胶内电泳分离。电泳中，核酸带负电荷，在电场中向正极移动。DNA在琼脂糖凝胶中的电泳迁移速率主要取决于以下6个因素： （1）样品DNA分子的大小 （2）DNA分子的构象：抽提质粒DNA过程中，由于各种因素影响，会获得三种构象的质粒，即超螺旋共价闭合环状DNA（cccDNA），开环DNA（ocDNA），线状DNA（liner DNA）。一般，超螺旋型移动速率最快，其次为现状分子，最慢的是开环状分子。 （3）琼脂糖浓度：琼脂糖浓度影响凝胶的孔径，一定大小的DNA片段在不同浓度琼脂糖凝胶中的迁移速度不同。通常凝胶浓度越低，则凝胶孔径越大，DNA电泳迁移速率越快，因此相对分子质量越大，选用的凝胶浓度应越低。本实验中采用的是0.9%的琼脂糖。 （4）电泳所用的电场 （5）缓冲液：本实验中采用的是TAE缓冲液，在精制DNA片段以及染色体DNA进行杂交时比较常用。 （6）温度 实验材料： 恒温振荡培养箱，高速冷冻离心机，漩涡振荡仪，水浴锅；1.5mL离心管，50mL离心管，不同型号的吸头，微量移液器等。 菌体：E.coli DH5α受体菌，具有Ampr标记的质粒pUC19 微波炉，电泳仪，制胶槽，电泳槽，梳子，锥形瓶，电子天平，手套，紫外灯，Eppendorf管，刀片，塑料薄膜等。 酶切后的DNA样品或其他待分离纯化的DNA样品；琼脂糖，TAE缓冲液，溴化乙锭（EB），6×上样缓冲液，DNA相对分子质量标准物DNA Marker λ/Hind III，5 mol/L pH5.2的醋酸钠，无水乙醇。 实验步骤： 1 实验前准备 （1）LB培养液+1%葡萄糖 按照附录所示配方配制LB培养液，并添加1%葡萄糖，115℃灭菌30min，分别分装于250mL锥形瓶中20mL，300mL锥形瓶中50mL；同时配制固体培养基用于活化菌株。 （2）枪尖：1000μL（蓝色）、200μL（黄色）、20μL（白色），灭菌备用 （3）