结核病实验室快速诊断方法介绍.pptVIP

结核病实验室快速诊断方法介绍 主要内容 细菌学诊断 免疫学诊断 分子生物学诊断 一、细菌学诊断 快速培养 噬菌体生物扩增法 （一）结核菌的快速培养 1. BD BACTEC MGIT 960培养系统 2. BacT ALERT 3D培养系统 3. 液体变色培养基 1. BD BACTEC MGIT 960 培养系统 基本原理： 培养瓶底部含有包被于树脂上的荧光显示剂，由于该显示剂为氧抑制性，当分支杆菌生长使氧消耗后，荧光显示剂被激活，而发出荧光。检测仪测试荧光强度，并判定结果。  BD BACTEC MGIT 960评价  优点： 快速 7-14天培养阳性 简便 比常规法操作简便 培养阳性率高于L-J法  无放射性污染 药敏只需5-7天 缺点： 污染率略高于L-J法， 　 产品依赖进口，价格较贵。 2．BacT ALERT 3D培养系统 原理 该系统采用产色检测技术检测培养系统中分支杆菌生长情况。因其所用的培养瓶底部有颜色感 　应器，当培养瓶中有细菌生长，C02产生、PH下降时，颜色感应器由绿色变成黄色。仪器自动连续检测，检测的数据输入计算机，根据计算结果自动显示培养瓶中有无分支杆菌生长。 3D培养基： 3．液体变色培养基 基本原理 液体变色培养基中的氧化还原显示器为一种无色四唑鎓(tetrazolium)盐，分支杆菌生长通过氧化还原系统，培养基中无色四唑鎓盐还原成粉红色、红色或紫色甲臢 ，甲臢不溶于水，以颗粒形式分泌至细胞表面，这样分支杆菌菌落就变成了用肉眼可以观察到的红或紫色。 液体变色培养基阳性结果报告时间与 BD BACTEC460相等，较L-J培养基提前5-10d。 二.免疫学诊断－结核抗体检测 细菌学检查是结核病诊断的金标准，但是由于涂片与培养检出率低，而 X线检查有一定误差及无法检出肺外结核等缺陷。而结核杆菌感染人体后，可刺激机体产生。因此，测定结核抗体及其含量有助于结 核病的辅助诊断。近几年来，国内外研究者采用脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)、结核菌重组蛋白(38KD)等作为抗原，以胶体金标记，建立简便、快速免疫学诊断方法。 测定方法： 酶联免疫吸附试验（ELISA） 免疫渗滤试验（DIGFA） 免疫层析试验（DICA） 结核抗体检测临床应用 1）辅助诊断结核病 2）作鉴别诊断 3）用于疗效观察 4）在结核病流行病学调查中的应用 5）作为器官移植并发结核感染的监测指标 结核抗体检测优点： 简便、快速 3-15分钟 灵敏 阳性率60-95% 特异 特异性80-95% 应用面广 各部位结核  有一定的假阳性和假阴性 结果判断带有主观性 缺乏有效的质控手段 结果判断带有主观性： 多数采用肉眼观察 法，根据显色深浅来判断结核抗体测定结果，因此带有主观性。理想的纠正方式是尽可能采用仪器测读法。 缺乏质控手段： 　结核抗体测定技术虽发展很快，试剂反应板上也带有质控点，但只能检测试剂的质量，而无法考核检测结果的准确性。 １.结核杆菌DNA扩增法 －PCR测定 PCR具有敏感、特异、快速等特点，对于MTB这类生长缓慢的病原菌诊断具有独特的意义。在我国，结核菌PCR实验研究积累了一定资料和经验，目前正处在逐步过渡到临床试用的重要转折阶段。在临床试验应用过程中确实存在一些亟待解决的问题。PCR检测假阳性和假阴性问题是影响其应用的关键问题。 　对于存在的问题对策如下： 扩增产物特异性鉴定－探针杂交 高质量试剂（建立国家级检定考评） 规范化操作（培训操作人员） 质量控制 （标准实验室） 　PCR杂交测定方法 PCR-ELISA测定 PCR杂交梳测定 荧光定量PCR ２. 结核杆菌RNA扩增法　　　　　　－ Gen-Probe 　　　　　　　　　　　　 3. 基因芯片检测基本原理 是将多种探针固定在玻璃等基片上，然 后与待测样本的DNA或RNA进行杂交，通过检 测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品 分子的数量和序列信息。由于该法同时将大量 探针固定于支持物上，所以一次可以对样品大 量序列进行检测和分析，从而解决了传统核酸 印迹技术的操作繁杂、自动