免疫酶细胞化学试验技术免疫酶细胞化学是免疫细胞化学-中国试剂网.PDF

中国试剂网 3.11.3.5 免疫酶细胞化学实验技术 免疫酶细胞化学是免疫细胞化学 （Immunocytochemistry,ICC ）中最常用的方 法之一，它是在抗原抗体特异反应存在的前提条件下，借助于酶细胞化学的手段， 检测某种物质 （抗原/抗体）在组织细胞内存在部位的一门新技术：即预先将抗 体与酶连结，再使其与组织内特异抗原反应，经细胞化学染色后，于光镜或电子 显微镜下观察分析的形态学研究方法。 40 多年前，Coons 及其同事利用荧光色素 （FITC ）标记抗体而开创的免疫 荧光抗体技术，具有一定的灵敏性、特异性、操作简单等优点，但亦存在抗体用 量大，标本不能长期保存、需较昂贵的荧光显微镜等问题。几乎在同一时期，电 子显微镜在医学生物学领域中得到了广泛的应用。为克服荧光抗体法的不足、并 能在超微结构水平定位抗原物质的存在部位，Nakane(1966 等成功地引入了酶代 替荧光色素标记抗体，进行组织细胞内抗原或半抗原的定位，开辟了酶标抗体技 术免疫酶细胞化学之路。 Sternberger （1970）等人在此基础上又作了改良，建立了非标记抗体酶法以 及 PAP 法。酶标抗体法确立至今已经 27 个春秋，不断发展、成熟。各种新技术 的引入，使新抗体相继问世，应运而生的抗体制造、经销商遍布世界各地，使 ICC 技术得到了更广泛的推广和应用，成为当今形态学研究领域中不可缺少的手段； 同时也有为临床病理诊断、肿瘤性质的判定、预后的估测等提供重要依据，是临 床实验室常规检查法之一。近年，伴随分子生物学、分子遗传学的惊人进步，ICC 技术在基因表达产物的观察，细胞功能动态分析中，亦发挥着重要作用。在此， 结合，笔者经验，介绍 ICC 染色中的主要程序：组织标本的固定、切片、染色 原理及步骤、结果判定及一些进展、特殊应用等供读者参考。 第一节 固定和切片 一、固定 若想得到理想的 ICC 染色结果、正确地判断抗原物质在组织细胞内的位置， 除需有良好酶和抗体外，保持组织细胞内抗原物质的不动性 （Immobility ）和免 疫活性也是至关重要的。换言之，如果抗原物质在组织细胞间弥散、丢失或失去 免疫活性，无论如何努力染色都是徒劳的，所以说固定是 ICC 染色中非常重要 的一环。ICC 与其它组织学技术不同，除要求保存良好的结构外，还需保存组织 中国试剂网 3.11.3.5 抗原的免疫活性。一般认为，新鲜组织能够最大限度地保存组织抗原的免疫活性， 但结构较差，易出现抗原弥散丢失现象。Cumming （1980）报告，不固定的组织 切片 ICC 染色时，环鸟苷酸含量丢失 80%以上。固定的目的是使构成组织细胞 成分的蛋白等物质不溶于水和有机溶剂，并迅速使组织细胞中各种酶降解、失活， 防止组织自溶和抗原弥散，保持组织细胞的完整性和所要检测物质的抗原性。因 此迅速充分固定是 ICC 染色成功的关键一步。用于 ICC 的固定剂种类较多，选 择时应根据所要检测物质的抗原性质和切片方法以及所用抗体特征等做最佳筛 选。制片及固定方法见第一章 ，下面介绍两种近年报道的新方法。 1．AMEX （Acetone Meth Enzoate Xylene ）法 是改良的冰冻置换法 （freezesubstitution ）的简称，主要用于石蜡包埋标本。Sato(1986 报告，该法具 有同新鲜 （未固定）组织冰冻切片同样的抗原保持性和石蜡切片的良好组织结构 保存。其机制为：组织在丙酮中固定 （脱水），组织细胞内水份逐渐被丙酮取代， 继之，用苯甲酸酯取代组织内丙酮，经二甲苯置换后，石蜡包埋。组织在20℃ 丙酮内过夜亦形成冰晶，所以原方法将组织先置4 ℃丙酮20～30min，再移入20 ℃丙酮过夜。实际上组织在4 ℃丙酮内过夜亦可得到同样效果。如在该固定液内 加入少量蛋白酶活性阻断剂，并采用低溶点石蜡包埋等，可获得更佳染色结果。 2 ．微波固定 （Microwave fixation ） 为近几年所注目的问题之一。该方 法能保持良好的组织结