试验四蛋白质的颜色反应.DOC

实验四 蛋白质的颜色反应 一、实验目的 熟悉一些常见蛋白质的颜色反应。 二、实验原理 蛋白质分子中的某些基团与显色剂作用，可产生特定的颜色反应，不同蛋白质所含氨基酸不完全相同，颜色反应亦不同。颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质亦可产生相同颜色反应，因此不能仅根据颜色反应的结果决定被测物是否是蛋白质。颜色反应是一些常用的蛋白质定量测定的依据。重要的颜色反应有： （一）双缩脲反应 将尿素加热到180℃，则两分子尿素缩合而成一分子双缩脲，并放出一分子氨。双缩脲在碱性溶液中能与硫酸铜反应产生红紫色络合物，此反应称双缩脲反应。蛋白质分子中含有许多和双缩脲结构相似的肽键，因此也能起双缩脲反应，形成红紫色络合物。通常可用此反应来定性鉴定蛋白质，也可根据反应产生的颜色在540nm 处比色，定量测定蛋白质。 （二）蛋白质的黄色反应 黄色反应是含有芳香族氨基酸特别是含有酪氨酸和色氨酸的蛋白质所特有的呈色反应。蛋白质溶液遇硝酸后，先产生白色沉淀，加热则白色沉淀变成黄色，再加碱颜色加深呈橙黄色，这是因为硝酸将蛋白质分子中的苯环硝化，产生了黄色硝基苯衍生物。例如皮肤、指甲和毛发等遇浓硝酸会变成黄色。 （三）米伦氏反应 米伦试剂为硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸和亚硝酸的混合物，蛋白质溶液加入米伦试剂后即产生白色沉淀，加热后沉淀变成红色。酚类化合物有此反应，酪氨酸含有酚基，故酪氨酸及含有酪氨酸的蛋白质都有此反应。 （四）茚三酮反应 蛋白质与茚三酮共热，则产生蓝紫色的还原茚三酮、茚三酮和氨的缩合物。此反应为一切氨基酸及α-氨基酸所共有。含有氨基的其他物质亦呈此反应。 三、实验器材 1.仪器：试管和试管架、滴管、水浴锅、酒精灯或电炉、量筒、滤纸片、烘箱、白明胶。 2.材料：蛋白质。 3.试剂：卵清蛋白液、0.5%苯酚溶液、1%白明胶液、米伦(Millon)试剂 、0.1%茚三酮溶液、浓硝酸、1%硫酸铜溶液、尿素、10%氢氧化钠溶液。 四、实验步骤 （一）双缩脲反应 1.取少许结晶尿素放在干燥试管中，微火加热，尿素溶化并形成双缩脲，释出的氨可用红色石蕊试纸试之。至试管内有白色固体出现，停止加热，冷却。然后加10%NaOH 溶液1mL 混匀，观察有无紫色出现。 2.另取一试管，加蛋白质溶液10滴，再加10% NaOH 溶液10滴及1%CuSO4溶液4滴，混匀，观察是否出现紫玫瑰色。 （二）蛋白质的黄色反应 在一试管内，加蛋白质溶液10滴及浓硝酸3～4滴，加热，冷却后再加10%NaOH 溶液5滴，观察颜色反应。 （三）米伦氏反应 1.用苯酚做实验：取0.5%苯酚溶液1mL 于试管中，加米伦试剂约0.5mL(米伦试剂含有硝酸，如加入量过多，能使蛋白质呈黄色，加入量不超过试液体积的1/5～1/4)，小心加热，溶液即出现玫瑰红色。 2.用蛋白质溶液做实验：取2mL 蛋白质溶液，加0.5mL 米伦试剂，此时出现蛋白质的沉淀(因试剂含汞盐及硝酸之故)，小心加热，凝固之蛋白质出现红色。 （四）茚三酮反应 取1mL 蛋白质溶液置于试管中，加2滴茚三酮试剂，加热至沸，即有蓝紫色出现，此反应必须在pH5～7进行。 五、注意事项 1.硫酸铜不能多加，否则将产生蓝色的Cu(OH)2。此外在碱溶液中氨或铵盐与铜盐作用生成深蓝色的络离子Cu(NH3)42+，妨碍此颜色反应的观察。 2.蛋白质溶液中如含有大量无机盐，可与汞产生沉淀从而丧失试剂的作用，如此试剂不能测定尿中的蛋白质。另外试液中还不能含有H2O2、醇或碱，因它们能使试剂中的汞变成氧化汞沉淀。遇碱必须先中和，但不能用盐酸中和。 六、思考题 1.氨基酸与蛋白质具有哪些共同的颜色反应？说明原因。 2.蛋白质除了可以实验中的这些颜色反应外，你还知道哪些蛋白质的颜色反应？