章分子直接进化技术.pptVIP

第九节分子直接进化技术 生物的自然进化 进化过程： 突变→自然选择→遗传后代 进化结果： 基因多样性：为完成同一功能所表现出的-----多个基因或同一个基因（同源性） 代谢途径的多样性：同样产物，多条途径（如木糖 木酮糖） 代谢产物的多样性：同一底物，不同产物 生物多样性 分子进化工程的种类 获取新基因的方法 常规的基因工程方法 已知的生物、基因和功能 新基因的理性设计和人工合成 根据已有基因的序列和功能进行设计 基因的直接进化（directed evolution) 可使已有基因获得新的特性 可获得自然界中不存在的基因 可解决许多新的理论和应用问题 基因直接进化的用途 改变酶的特性----多功能或单功能酶 提高酶活性---天门冬氨酸氨基转移酶活性提高30倍 改变底物特异性和对映异构体选择性----酯酶可水解非天然酯类 改变酶的工艺性----冷适应和热适应酶 改善酶的稳定性----二体酶变为单体酶或单体酶变为二体酶 获取许多新的理论知识 TLPs 的失活曲线 TLP-ste突变蛋白的三维结构 酶拓扑结构的变化 蛋白质的耐热机制 天然耐热蛋白质特性： 减少内腔体积；引入盐桥束；减少表面积/体积比；除去氧化还原活性基；埋藏暴露的疏水基；除去?-支链氨基酸；除去能脱氨基的氨基酸。 所有耐热蛋白质的氨基酸同源性低至36%，最高不超过75%。 分子进化耐热蛋白质特性： 邻-硝基苯酯酶（p-nitrobenzyl esterase）突变体8g8的了稳定性提高了17?C，但突变的氨基酸数仅有13个，与天然酯酶同源性高达97%。 基因直接进化的步骤 突变 基因突变库的建立 筛选 基因突变库的活体或离体筛选 基因复制与遗传 建立基因突变库的方法 PCR方法 1）易错PCR法 2）随机引物延伸法 DNA重组装（DNA Shuffling)方法 1）外显子、单基因和基因家族的重组装 2）随机多重组PCR法(RM-PCR) 随机片段活体突变法 线状基因和随机片段共转化酵母细胞 易错PCR方法 Random-priming recombination(RPR) 基因突变库的筛选方法 活体筛选法 遗传互补筛选法 活体---离体筛选法 噬菌体显示法；细胞表面显示法（细菌、纤毛虫细胞表面） 离体筛选法 1）核糖体显示技术 2）RNA-蛋白质融合技术(RNA显示技术） 噬菌体显示筛选模式 噬菌体显示的几种类型 M13噬菌体pIII和pVIII的显示 RNA-蛋白质的融合 Myc ds-DNA的富集 谢谢大家！ 交错延伸PCR突变法 质粒肽库的设计和筛选 * * 随机引物重组法 随机挑取枯草杆菌蛋白酶 RPR库中10个克隆序列 DNA重组装原理图 (DNA shuffling) 1. DNaseI产生随机片段；2. 随机片段变性；3. 随机片段复性； 4. 延伸 反复重复2-4步后，可获得全长DNA片段 随机挑取枯草杆菌蛋白酶DNA 重组装库中10个克隆序列 Table 1 Frequency of active clones obtained after DNA shuffling under different conditions a As suggested in ref. 7. b Clones exhibiting 10% wild-type subtilisin E activity. DNA重组装过程 多重组和随机多重组PCR原理图 RM-PCR法构建 随机重组装库(A)和剪接库(B) 丝状噬菌体的生活周期 核糖体显示技术 RNA-蛋白质融合技术 寡霉素与核苷酸的连接 *