试验一十八荧光原位杂交试验.pptVIP

实验一十八 荧光原位杂交实验 一、实验目的 通过实验了解荧光原位杂交技术的基本原理和在生物学、医学领域的应用。 掌握原位杂交技术的操作方法，熟练掌握荧光显微镜的使用方法。 二、实验原理 FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。 三、实验用具及材料 Y染色体探针、人外周血中期染色体细胞标本、恒温水浴锅、培养箱、染色缸、载玻片、Nikon E-400、荧光显微镜、盖玻片、封口膜、200μL移液器、20μL移液器、暗盒、指甲油、甲酰胺、氯化钠、柠檬酸钠、氢氧化钠、吐温20。 四、实验方法及步骤 1.探针及标本的变性 探针变性： 标本变性 ： 2.杂交 DNA探针10μL滴于已变性并脱水的玻片标本上，盖上18×18盖玻片，用Parafilm封片，置于潮湿暗盒中37℃杂交过夜（约15～17h）。 3.洗脱 4.杂交信号的放大 5.封片 可采用不同类型的封片液。如果封片液中不含有Mowiol（可使封片液产生自封闭作用），为防止盖片与载片之间的溶液挥发，可使用指甲油将盖片周围封闭。封好的玻片标本可以在-20～-70的冰箱中的暗盒中保持数月之久。 6.荧光显微镜观察FISH结果 先在可见光源下找到具有细胞分裂相的视野，然后打开荧光激发光源，FITC的激发波长为490nm。细胞被PI染成红色，而经FITC标记的探针所在的位置发出绿色荧光。 本实验使用的是Y染色体上的特异序列，因此在男性外周血染色体标本的杂交中呈阳性，即使在未分裂的细胞中，也可以观察到明显的杂交信号。照相记录实验结果。 观察结果 (a)间期细胞 (b)中期细胞，Y染色体荧光标记探针 五、作业及思考题 1.通过实验总结荧光原位杂交实验的技术关键。 2.实验中会不会出现假阳性，为什么？ * *