中国医科大学《免疫学》实验四 抗体的应用3.pptVIP

实验原理 在pH值8.6的琼脂凝胶中，抗体球蛋白只带有微弱的负电荷，而且它分子又较大，所以泳动慢，受电渗作用的影响也大，往往不能抵抗电渗作用，故在电泳时，反而向负极倒退。而一般抗原蛋白质常带较强的负电荷，分子又较小，所以泳动快，虽然由于电渗作用泳动速度减慢，但仍能向正极泳动。如将抗原置阴极，抗体置阳极，电泳时，两种成分相对泳动，一定时间后抗原和抗体将在两孔之间相遇，并在比例适当的地方形成肉眼可见的沉淀线。这样由于电泳的作用，不仅帮助抗体定向移动，因而加速了反应的出现，而且也限制了琼脂扩散时，抗原抗体向四周自由扩散的倾向，因而也提高了敏感性，本法比琼脂扩散法的灵敏度要高10～16倍，而且反应时间短，可用于各种蛋白的定性和半定量测定。 三、优点 1、具有操作简便，只要将染色的单个细胞推入仪器中，就会得出数据。 2、具有较高的灵敏度及测定速度，而且每次可测出许多数据，一般情况下，每秒可测5000个细胞，能迅速分析和记数大量细胞，并能准确统计群体中荧光标记细胞的比例。 3、应用广泛，即可用于测定细胞活力、繁殖周期和细胞定型分析，也可区别死亡细胞、分裂细胞和静止细胞群，既可测定DNA和RNA、测凋亡峰，又可测蛋白含量，特别是胞浆蛋白。 实验四 抗体的应用 中国医科大学免疫学教研室 尉冰 对流免疫电泳 溶血反应 巨噬细胞NO水平测定 主要内容 对流免疫电泳(Counter immunoelectrophoresis test) 一 实验目的 1 熟悉对流免疫电泳的原理 2 掌握对流免疫电泳的操作方法 3 了解对流免疫电泳的应用 二 实验原理 利用琼脂双向扩散与电泳技术结合的方法,根据抗原与抗体所受电场力与电渗力合力的大小,使它们发生对向移动,在它们浓度与比例合适处形成肉眼可见的沉淀物。 Ag ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ Na+ 羧基糖 - + Ab PH=8.6 Ag ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ Na+ 羧基糖 - + Ab PH=8.6的缓冲液 对流免疫电泳示意图 三、实验目的 将人IgG免疫羊，通过对流免疫电泳检测羊抗人IgG的免疫效价，以次手段来判定免疫是否达到预期结果。 四、实验材料 1.5%琼脂凝胶板(已制好）：用pH8.6 0.05M巴比妥-巴比妥钠缓冲液配制 电泳缓冲液：pH8.6 0.05M巴比妥-巴比妥钠缓冲液配制 抗原：人IgG（Ag)；抗体：羊抗人IgG血清(Ab) 打孔器 微量加样器 电泳仪及电泳槽 滤纸 五、 实验步骤 制板：将洁净玻片置于水平台面上，用移液管吸取3.5-4ml熔化的1.5％琼脂加于载玻片上，待冷凝。 打孔：按图中所示打孔，孔间距5mm 加样：用微量加样器吸取20ul抗原及抗体分别加入两孔 电泳：150V，电泳1.5-2h。 电泳槽 六、 实验结果 七、注意事项 1. 抗原、抗体的电极方向不能放反 2. 电泳时电流不宜过大,以免蛋白质变性 3. 加样时样品不要溢出 4. 琼脂胶较脆，跑完电泳后拿出时应小心，避免弄碎 溶血反应 原理： 试验系统：待测抗原+待测抗体+补体 指示系统：SRBC+溶血素 溶血说明有待测的抗原或者抗体 没溶血说明没有待测的抗原或抗体 1.步骤 （1）取3只小试管，标号 （2）加样 （3） 37℃水浴或温箱孵育，10分钟 1 2 3 溶血素 0.2ml 0.2ml - sRBC 0.2ml 0.2ml 0.2ml 补体 0.2ml - 0.2ml 生理盐水或PBS 0.4ml 0.6ml 0.6ml 利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动 状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、 快速定量分析，同时对特定群体加以分选 的现代细胞分析技术。 流式细胞术（Flow Cytometry，FCM） 一、原理 Forward Angle Light Scatter FALS Sensor Laser 90 Degree Light Scatter FALS Sensor 90LS Sensor Laser 二、流式细胞仪构造 流动室及液流驱动系统 激光光源及光束形成系统 光学系统 信号检测与存储、显示、分析系统 细胞分选系统 流动室及液流驱动系统 单细胞悬液在细胞流动室里被鞘流液包绕通过流动室内的一定孔径的孔,检测区在该孔的中心，细胞在此与激光垂直相交，在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区。 激光光源及光束形成系统 流式细胞仪可配备一根或多根激光管，常用的激光管是氩离子气体激光管，它的发射光波长488nm,此外可配备氦氖离子气体激光管（波长633nm）。目前台式机FCM，大多采用氩离子气体激光器。 激光(laser)是—种相干光源，它能提供单波长、高强度及稳定性高的光照，是细胞微弱