大肠杆菌o157-h7实验诊断的研究进展 .pptVIP

循环参数 3．引物延伸 ：引物延伸是DNA聚合酶将脱氧单核苷酸逐一地加到引物的3’一OH末端，引物延伸温度取决于DNA聚合酶的最适温度。如用TaqDNA聚合酶，一般取70-75 ℃ ，常用72 ℃ 。 延伸步骤的时间则取决于目标序列的长度、浓度和延伸温度。目标序列越长、浓度越低、延伸温度越低，则所需的延伸时间越长；反之，目标序列越短、浓度越高、延伸温度越高，所需的延伸时间则越短 一般而言，每1000个碱基的序列，延伸时间1分钟便足够了。对于扩增100—300个碱基的短序列片段，可省去延伸温度这一步骤，而采用快速简便的变性、退火双温循环。这是因为TaqDNA聚合酶即使在退火温度下仍保持很强的活性，而延伸过程可在退火温度转变为变性温度的过程中完成。 * 循环参数 扩增产物长度 100bp 500bp 1000bp 2000bp 94℃变性时间（秒） 30 30 60 60 55℃复性时间（秒） 30 30 60 60 72℃延伸时间（秒） 30 38 120 180 一般作25-30个循环即可，进行最后一次循环时间、延伸时间增加5分钟。 * 大肠杆菌O157: H7实验诊断研究进展 * 大肠杆菌O157: H7感染临床表现 出血性肠炎：鲜血样便，腹部痉挛性疼痛，低热或不发热。 溶血性尿毒综合征（HUS）：主要发生在儿童，常出现在腹泻后数天或1-2周。病死率一般在10%，各别可高达50%。 血栓性血小板减少性紫癜（TTP）：主要发生在成年人，尤其老年人。病人主要表现为发热、血小板减少、溶血性贫血、肾功能异常等症状，病情发展迅速，病死率高，有时可出现70%的病人死亡。 * 大肠杆菌O157: H7传染源和传播途经 大肠杆菌O157: H7基本上是一种食源性病原菌，可通过食用大肠杆菌O157: H7污染的牛肉、牛奶、牛肉或制品、鸡肉、蔬菜、水果、饮料、水等感染,也可通过人与人、人与动物密切接触传播。 在实验室，大肠杆菌O157: H7可以感染小鼠、鸡、兔、猪、牛等动物。 大肠杆菌O157: H7的感染已成为世界性的问题 我国情况也不容乐观 * 一、细菌培养与鉴定 1．分离培养 早期培养对确定病原有重要意义。 培养的对象首先是急性血性腹泻患者，其次是HUS、TTP等住院病人，再其次是高危接触者。 培养基： 山梨醇麦康凯琼脂、胰胨大豆琼脂 改良的伊红美兰 、改良的SD-39（MSD）琼脂 添加了头孢克肟 和 亚碲酸钾的山梨醇麦康凯琼脂（TC-SMAC） 添加了头孢克肟和鼠李糖（0.5%)的山梨醇麦康凯琼脂（CR-SMAC） “科玛嘉”大肠杆菌O157: H7显色培养基 四溴荧光亚甲基兰琼脂 H7抗血清—山梨醇发酵培养基 *  增菌液： 含10mg/L 新生霉素的EB肉汤或肠道增菌液 含10mg/L 新生霉素或10mg/L盐酸-吖啶黄的胰蛋白胨大豆肉汤 新生霉素MEC肉汤 月桂基胰蛋白胨肉汤 加入下例任何一种抑制剂均可增加培养基的选择性 头孢克肟 0.05mg/L 亚碲酸钾2.5mg/L 新生霉素10mg/L 万古霉素40mg/L * 2．免疫磁珠分离法 免疫磁珠分离法是将特异性抗体吸附于一种能被吸附的磁性珠子上,然后利用抗原抗体反应特性将样品中的大肠杆菌O157: H7富集起来。 方法:1.增菌;2.取样品1ml加大肠杆菌O157: H7免疫磁珠20ul;3.轻轻混合10分钟;4.将试管插入磁架上;5.吸取上清;6.加PBS,重复3-5过程;7.取管壁沉淀物,划线接种于CT-山梨醇麦康凯琼脂(C-头孢克肟,T-亚碲酸钾)等选择性培养基。37℃培养6-24小时，挑取可疑菌落进行鉴定。 * Chapman等 共检测大便标本690份, 免疫磁珠分离法检出25 。用免疫磁珠分离法分离的l2株大肠杆菌O157: H7中,直接培养阳性仅5株。 Wright等将接种大肠杆菌O157: H7的碎牛肉标本置加有万古霉素和头孢克肟的缓冲蛋白胨水培养,然后直接或用大肠杆菌O157抗体包被的磁珠分离细菌后,接种于CT-SMAC,结果直接次培养检出量为200cfu/g,而免疫磁珠分离法仅需 2cfu/g 。 Chapman等先用EC肉汤增菌,然后用免疫磁珠分离法富集牛粪便大肠杆菌O157: H7菌株,再用选择性培养基分离，并与CR-SMAC和CT-MAC直接培养作比较。用前者检测接种12株不同大肠杆菌O157: H7菌株的牛粪便悬液,其敏感性比在两种培养基上