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第17章 高效液相色谱法(HPLC) 仪器分析教研室 陈 稚 HPLC High Performance Liquid Chromatography 17.1 概 述 17.2 高效液相色谱仪 17.3 高效液相色谱的固定相和流动相 17.4 高效液相色谱法的主要类型 补充 高效液相色谱法 17.1.4 现代高效液相色谱法的特点： (1)高效： (2)高压：HPLC工作压力高达20MPa-30MPa。 (3)高速：分离一个样品只需几分钟至几十分钟。 (4)高灵敏度： 紫外检测器的检测限可达10－9g， 荧光检测器的检测限可达10－12g 。 17.1.5 高效液相色谱法的优、缺点 高效液相色谱法的优点是： 其缺点是：价格昂贵，要用各种填料柱，容量小，流动相消耗大且有毒性的居多。 17.1.6 色谱分离的过程 17.1.6 样品分子在色谱柱中的分离过程 17.1.6 样品分子在色谱柱中的分离过程 色谱分离的实质是样品分子（即溶质）与溶剂（即流动相或洗脱液）以及固定相 分子间的作用，作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。 17.2 高效液相色谱仪结构 输液系统 17.2 高效液相色谱仪结构 输液系统 17.2 高效液相色谱仪结构 输液系统 17.2 高效液相色谱仪结构 输液系统 17.2.1 高压输液泵 作用：将流动相以稳定的流速或压力输 送到色谱系统。输液泵的稳定性直接关系到分析结果的重复性和准确性。 17.2.1 高压输液泵 性能：⑴足够的输出压力 ⑵输出恒定的流量 ⑶输出流动相的流量范围可调节 ⑷压力平稳,脉动小 17.2.1 高压输液泵 注意事项： ⑴防止任何固体颗粒进入泵体 ⑵流动相不应含有任何腐蚀性物质 ⑶泵工作时防止溶剂瓶流动相用完 ⑷不要超过最高压力 ⑸流动相应先脱气 补充、液相色谱中的柱外谱带展宽 色谱柱本身以外区域的谱带展宽，称为柱外谱带展宽。 样品注入色谱柱后，在色谱柱以外的任何死空间（如进样器、柱接头、连接管和检测器）中，样品分子的扩散和滞留，都会引起色谱峰的扩展，而使柱效降低，所以柱外死体积影响是不能忽略的。 17.2.2 进样系统 常用内壁抛光过的不锈钢制成 颗粒直径早期大（20~75μm），柱管径一般为2mm，柱长为50~100cm. 近年来，用高效微型填料（3~10μm）管径为4~5mm，长为10cm~50cm的直形不锈钢柱。 每米柱效可达8万塔板数 柱性能指标: 柱压 理论塔板高度H 理论塔板数n 对称因子f 17.2.4 检测系统 检测器应具有： 溶质性检测器有：紫外、荧光、电化学检测器等 总体检测器有：示差折光、介电常数检测器等 17.2.4 荧光检测器 特点： 有非常高的灵敏度和良好的选择性，灵敏度要比紫外检测法高2?3个数量级，特别适合于药物和生物化学样品的分析。 17.2.4 数据处理 计算机进行峰面积的积分、分析结果的计算、误差的分析或色谱图的输出，记录的信号进行程序化、自动化处理。 复习: 高效液相色谱仪结构 输液系统 17.2 Main stages of HPLC analysis Prepare Sample inject into column elute with mobile phase detect sample components identify and quantify 17.2 高效液相色谱仪的工作流程 17.2 高效液相色谱仪的工作流程 17.2 高效液相色谱仪的工作流程 17.2 高效液相色谱仪的工作流程 17.3 高效液相色谱法的应用 高效液相色谱的应用： 医药卫生、 食品、 17.3 高效液相色谱法的应用 高效液相色谱的应用： 医药卫生、 食品、 环保 等各个领域最为重要的分离分析技术。 17.3 HPLC法测定人血浆中氨苄青霉素浓度 南京市儿童医院，徐进，儿科药学杂，1999年第5卷第2期色谱条件 色谱条件 : 岛津LC—10A D高效液相色谱仪； RF一l0AxL荧光检测器，荧光激发波长360nm，发射波长430nm; LD一I0A泵，分析柱为Spherisorb ODS 5μm, 200