第八章 PCR技术及其应用幻灯片.pptVIP

第八章 PCR技术及其用 PCR仪 PCR仪 1.PCR技术的原理 2. PCR的扩增步骤 PCR的反应程序P137 （3）第四步 延伸（extension） 温度循环 PCR　反应体系 ③引物的碱基序列 ④引物的碱基组成 3）避免形成引物二聚体（dimer） 4） 引物中的核苷酸序列与非靶DNA的核苷酸序列以及靶DNA中引物互补序列以外的核苷酸序列之间的相似性不得超过70%，并且不能有连续8个以上相同的核苷酸序列。 ⑤引物的Tm值 ⑧套嵌引物（nested primers) ② 最适温度高 ④ Taq DNA聚合酶的激活剂 第三类酶： 具有第一类酶的DNA聚合特性，不拥有第二类酶的逆转录功能，但是它们具有3’-5’方向的外切酶活性。 6. PCR的特点 （4）简便 二 A-T 克隆法 pCR2.1 pCR2.1的MCS pCR2.1-topo pCR1000 Promega 公司的T载体系列 T vector的克隆过程——简便！ 一 反向PCR P143 （2）12种锚定引物 （3）5’端的随机引物 （4）随机引物与锚定引物成对扩增 （5）随机-锚定引物PCR的产物电泳比较 实时荧光定量PCR的定量方式 在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念—Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。 1、SYBR荧光染料 2、TaqMan探针 但在进行延伸反应时，聚合酶的 5’ 外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离。荧光基团便可发出荧光。 荧光强度与PCR产物量呈正比关系 Tail-PCR技术路线 Tail-PCR的各级反应 Tail-PCR的技术难点： Tail-PCR不需要Southern blot就可以扩增并回收插入位点的侧翼序列,极大的简化基因克隆手续。但存在下列技术难点： 反应步骤复杂，各个循环条件的设计是比较麻烦； 简并引物因物种而异，需要预备试验； 由于多级反应，容易因污染而失真。 第四节 与反转录相关的PCR 扩增RNA模板。如mRNA或RNA病毒。 Temin,H.发现反转录酶， 1975诺贝尔奖 技术关键： 利用反转录酶，把RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。 RNA template 3’ 5’ 下游引物 cDNA first strand 3’ 5’ 上游引物 cDNA first strand cDNA second strand 3’ 5’ 3’ 5’ 反转录酶 Taq酶 PCR Reverse transcription (RT) 下游引物 上游引物 Taq酶 * 西南大学生物技术专业 基因工程 * 一、cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends, RACE) 用于克隆全长cDNA的5’和3’末端序列。 5’ RACE * 西南大学生物技术专业 基因工程 * 3’ RACE mRNA differential display RT-PCR （1）3’端的锚定引物 Oligo(dT)引物的3’端加两个核苷酸（倒数第二个不再是T）。 AAAAAAAAAAAAAAAA mRNA 3’ 5’ VN TTTTTTTT V：A、G or C N: A、G、T or C 5’ 3’ 二 差异显示PCR AG TTTTTTTT 5’ 3’ CG TTTTTTTT 5’ 3’ GG TTTTTTTT 5’ 3’ TG TTTTTTTT 5’ 3’ AA TTTTTTTT 5’ 3’ CA TTTTTTTT 5’ 3’ GA TTTTTTTT 5’ 3’ TA TTTTTTTT 5’ 3’ AC TTTTTTTT 5’ 3’ CC TTTTTTTT 5’ 3’ GC TTTTTTTT 5’ 3’ TC TTTTTTTT 5’ 3’ 10 mer AAAAAAAAAAAAAAAA mRNA 3’ 5’ VN TTTTTTTT 5’ 3’ 扩增cDNA第一链。 RT VN TTTTTTTT 5’ cDNA 3’ NNNNNNNNNN 5’ 3’ NNNNNNNNNN 5’ 3’ cDNA第二链，并PCR 12种锚定引物，若与20种随机引物，可组成240组引物。 引物组合： 240组在能分出20000多条带！ 实验结果： 如果每条带相当于一种mRNA，20000 mRNA基本上反映了一种特定细胞中全部的mRNA。 在测序胶上，每组扩出50-100条长度为100-500b