第3章免疫原和抗血清的制备.ppt

制备高效价、高特异性、高亲和力的抗体，是很重要的技术。而制备纯的、理想的抗原是制备特异性抗体的先决条件。制得的抗体又可以用于纯化和检测抗原。 有关概念 免疫原：指用于接种动物，使之产生抗体的抗原。 第一抗体：用已知的免疫原接种于人或动物，机体会产生与之相应的、存在于血清中的抗体，这种抗体在实验中常称为第一抗体（简称一抗Ab1）。 第二抗体：由于Ig有同种型抗原特异性，将人Ig接种动物或将动物Ig接种异种动物可制备出抗抗体，又称第二抗体(简称二抗Ab2）。 抗血清：用免疫接种方法制备的含抗体血清习惯上称为抗血清（antiserum）也称免疫血清。 例如：Ag 1→家兔→Ab1（一抗） →绵羊→羊抗兔Ig（二抗） Ag 2→家兔→Ab2（一抗） 组织粉碎的方法： 高速捣碎法－组织捣碎机捣碎 研磨法－用玻璃匀浆器或乳钵研磨 2、组织细胞或培养细胞可溶性抗原的制备： 4、离子交换层析法： 原理：利用一些带离子基团的纤维素或凝胶，吸附交换带相反电荷的蛋白质抗原。各种蛋白等电点不同，所带电荷量不同，与纤维素结合能力有差别。逐步增加洗脱液离子强度，梯度洗脱。 (1)亲和层析支持物的选择 应符合以下条件： ①非特异性吸附低； ②液体流速快； ③在各种pH和高浓度盐溶液中稳定； ④有合适丰富的化学基团，与蛋白质或其它化合物结合； ⑤有丰富的微孔，以增加结合容量。 最常用的支持物是Separose4B 木瓜酶 胃蛋白酶 1.酶裂解法： IgG片段的制备 IgG Fc+2Fab Fc段可用于制备抗重链血清。 IgG F(ab\)2+Fc\ F(ab\)2作为抗体试剂用于实验。 2.氧化法和还原法： 能将Ig轻重链分开，多用还原法。 1、超速离心法（常用于分离亚细胞成分） ●差速离心法－低速和高速离心交替进行 ●密度梯度离心法－区带离心法 原理：利用各颗粒在梯度液中沉降速度不同，使具有不同沉降速度的颗粒处于不同密度的梯度层内，达到分离的目的。 适用于大分子抗原的分离，如：IgM、C1q等。 也用于较轻的抗原物质，如：载脂蛋白A （二）可溶性抗原的纯化 要制备特异性高的抗血清，通常要纯化抗原，一般可采用以下方法： 核酸去除法－氯化锰、硫酸鱼精蛋、链霉素 盐析法－硫酸铵、硫酸钠。是经典的方法 有机溶剂沉淀法－乙醇、丙酮 聚合物沉淀法－聚乙二醇 2、选择性沉淀法： 原理：根据蛋白质理化特性的差异，采用各种沉淀剂或改变某些条件，促使蛋白质抗原成分沉淀。从而达到纯化的目的。 优点是：简单方便。 缺点是：纯度不高 利用凝胶的分子筛作用，对分子量不同的蛋白质进行分离 3、凝胶过滤法 离子交换剂：离子交换纤维素、离子交换凝胶、离子交换树脂 原理：利用生物大分子之间具有的专一性亲和力而设计的层析技术。如：抗原和抗体、激素和受体、IgG和SPA 优点是：纯度高、简单快捷。 缺点： 成本贵。 5、亲和层析法： (2)配体的选择条件： ①抗原或抗体必须单一特异性； ②抗原与抗体必须具有较高的亲和力； ③配体必须有一个适当的化学基团。 (3)抗原或抗体与支持物的结合： ①活化：溴化氰可活化Separose4B ； ②接“手臂”：带“手臂”琼脂糖有氨基琼脂糖、羧基琼脂糖、溴乙酰琼脂糖、重氮盐衍生物琼脂糖、疏基琼脂糖。 (4)亲和层析条件的选择： ①封闭活性基团：用无关蛋白质或三乙醇胺过柱； ②除去未结合和结合不牢的蛋白：先用NaHCO3洗脱，再用解脱剂处理； 解脱剂：3mol/L 硫氰酸钾（或钠）、0.1mol/L pH2.4甘氨酸缓冲液 6、电泳法： 利用蛋白质分子量和电荷量不同，在电场中的迁移率不同，进行分离。 （三）纯化抗原的鉴定 蛋白含量测定：紫外吸收法、双缩脲法、酚试剂法 分子量测定：SDS、凝胶过滤 纯度鉴定：醋酸纤维膜电泳、SDS、毛细管电泳、等电聚焦、高效液相层析 免疫活性鉴定：双向免疫扩散、免疫电泳、ELISA 三、半抗原性免疫原的制备 半抗原(hapten)：仅有抗原性而无免疫原性的物质如多肽、甾体激素、核苷、某些药物等 载体(carrier)：赋予半抗原以免疫原性的物质 ①蛋白质：牛血清白蛋白（最常用）、人血清白蛋白、兔血清白蛋 白、牛甲状腺球蛋白、血蓝蛋白 ②多肽聚合物：多聚赖氨酸（polylysine） ③大分子聚合物：羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose, CMC) 　　　　 聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone,PVP） （一）载体 ①物理方法：利用通过电荷和微孔吸附半抗原吸附的载体有CMC、PVP、硫酸葡聚糖等