绿色棉纤维葡萄糖苷转移酶基因(gh3gt4)与苯丙氨酸解氨酶基因(ghpal1)的克隆及表达研究-生物化学与分子生物学专业论文.docx

石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除 文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究 做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意。研究生签名：时间：年月日使用授权声明本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主 管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文在学校图书馆保存并允许被查阅。 有权自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提供检索服务。有权将学位论文的标题和摘要汇编 出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日摘要彩色棉是指棉花（Gossypium）成熟吐絮时棉纤维带有天然颜色的棉花类型。由于其纤维天然具 有色彩，在棉纺织过程中不需要化学漂染等工艺处理，其棉织物和棉纱颜色自然、质地非常柔软并 且永不褪色，对环境和人体健康无危害，因此又被人们称为“生态棉”（ecologicalcotton）。目前 国内外彩色棉品质普遍存在的问题是：铃小、产量与衣分偏低，色彩单一且色素遗传不稳定，绒短、 比强度差，所以彩色棉不能被大面积推广。虽然利用传统的育种方法培育出了一些新的彩色棉品种， 使彩色棉产量和纤维长度在一定程度上得到了提升，但无法解决彩色棉纤维颜色单一、色素不稳定 等问题。人们希望通过基因工程技术来改良彩色棉品种，但由于对彩色棉纤维色素形成分子机制尚 不清楚，利用基因工程技术对彩色棉的改良研究进展缓慢。目前很多研究认为彩色棉纤维色素是类 黄酮化合物，所以，克隆彩色棉类黄酮合成途径的关键基因，明确其调控机制，将对利用基因工程 手段解决目前彩色棉存在的问题具有十分重要的理论意义和应用价值。本研究从类黄酮合成途径中 选择了葡萄糖苷转移酶和苯丙氨酸解氨酶两条关键基因，研究结果如下：1. 分别以拟南芥（Arabidopsis thaliana）PAL基因氨基酸序列（AAC18870.1）与葡萄（Vitisvinifera） 3GT 基因氨基酸序列（BAB41020）为探针，在GenBank 中与棉花EST 进行tBLASTn 比对，将同源 性高的EST 序列拼接后获得一条棉花PAL基因全长cDNA序列与一条棉花3GT基因全长cDNA序 列，根据电子克隆所得到的完整cDNA序列，保守性分析后设计引物，以绿色棉纤维总RNA反转 录获得的cDNA为模板，通过RT-PCR扩增获得了两条新的基因cDNA序列。Blastx序列分析发现 克隆的2 条序列分别属于苯丙氨酸解氨酶基因家族与葡萄糖苷转移酶基因家族，将它们命名为 GhPAL1（GenBank登录号：JN032297）与Gh3GT4。GhPAL1全长2347bp，编码721 个氨基酸，具 有2个功能域，即PAL-HAL和Tyr_2_3_mutase；Gh3GT4全长1663bp，编码451个氨基酸, 在C- 端具有高度保守的PSPG box。2. 通过实时荧光定量PCR技术分别对两个基因在绿色棉及对应的近等基因系白色棉不同发育天 数纤维细胞和不同器官的表达进行分析，从表达特征来看，GhPAL1基因在棉纤维、根、茎、叶和花 中都有表达，但在纤维、特别是发育早期纤维中优势表达，在花后6d绿色棉纤维细胞中的表达量是 同期白色棉纤维的6倍以上；Gh3GT4基因主要在棉纤维中表达，在棉花根、茎、叶和花中几乎不表 达，在绿色棉纤维细胞发育的每个时期其表达量都高于白色棉，花后9d与27d出现两次表达高峰期， 与绿色棉纤维色素分两次沉积于纤维中腔和次生壁内层相吻合。因此我们推测GhPAL1与Gh3GT4基 因表达活性与绿色棉纤维着色进程之间存在一定的相关性，可能参与绿色棉纤维的色素合成过程并 发挥着重要作用。3. 为初步探究GhPAL1与Gh3GT4基因的功能，构建了pANDA35HK-GhPAL1/Gh3GT4 RNAi 干扰表达载体，并通过根癌农杆菌侵染绿色棉下胚轴，获得pANDA35HK-GhPAL1 转基因再生植株， 为该基因在绿色棉纤维中的功能验证提供了实验材料。关键词:绿色棉； 苯丙氨酸解氨酶；葡萄糖苷转移酶； 实时荧光定量PCRAbstractColoredcottonisakindofspecialtypecotton,whichcontainspigmentincottonfiber.Nowadays, naturallycoloredcottonbecomesmoreandmoreattractivetotextileindustryandcottonproduction. Becausenaturallycoloredcottonis