乙肝病毒cccDNA检测幻灯片.pptVIP

乙型肝炎病毒cccDNA ——检测方法与应用价值 什么是HBV cccDNA? 即共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA)。乙肝病毒感染宿主细胞后在细胞内复制并建立感染状态，病毒松弛环状DNA（rcDNA）进入细胞核，利用宿主DNA聚合酶和拓扑酶等“修复”形成的、结构完整的、超螺旋双链DNA分子。 设计一对特殊引物：跨双缺口引物　 正义引物P1 ：与负链互补结合，位于正 链缺口上游 反义引物P2 ：与正链互补结合，位于负 链缺口下游 目的：rcDNA不被扩增 与定性法比较增加了一个荧光探针，探针位于扩增片段区（负链缺口下游），与cccDNA的负链互补。 标准曲线方程YCt= 42.0827-3.5554logXcopy 相关指数： R2=0.995 灵敏度至少可以达到103copy/ml 侵入者探针法定量检测cccDNA的优缺点 优点：线性信号放大，特异性比荧光 PCR法强 缺点：灵敏度低：104copy/ml 1.选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR) 2.侵入者分析法（Invader assaay） ?嵌合引物荧光PCR法 现有的几种cccDNA检测技术简介 3. 嵌合引物荧光PCR法 Shao, et al. J Virol Methods 2003； 112：45-52 + P N N：与HBVDNA非同源片段 5’ N 5’ 3’ 3’ p + rcDNA cccDNA P N N P2 5’ 3’ 5’ 3’ 3. 嵌合引物荧光PCR法 嵌合引物荧光PCR的优缺点 优点：克服了荧光PCR法的部分缺陷，灵敏 度比侵入法提高 缺点：仍不能完全避免待测标本中存在的 rcDNA被非特异性扩增 无论是选择性荧光PCR，还是侵入者探针法或嵌合引物荧光PCR，本身都不能解决在高rcDNA背景条件下的假阳性问题，必须结合抽提分离、酶切纯化等步骤，以提高特异性。 三、影响cccDNA池的因素 1.cccDNA池的自身恒定 ? cccDNA池：感染肝细胞核内HBV cccDNA的 含量在无外来干扰的情况下保 持恒定(5－50copy/cell) ? 病毒自身调节：关于病毒的进化 关于病毒的“思维” 病毒自身的调节 ? 外来压力：打破病毒含量自身恒定的结果 2.抗病毒药物对cccDNA的影响 现有抗病毒药物，包括干扰素和各种核苷类似物，可以一过性地减少cccDNA，但均不能清除cccDNA 细胞核内cccDNA含量的相对稳定性，决定了长疗程抗病毒治疗的必要性 3.肝外组织也是cccDNA的储存池？ ·肝外组织细胞中HBV标志的存在情况： 　肾、胰腺、肺、心肌、心包膜、胃肠黏 膜、皮肤、睾丸、前列腺、唾液腺 等组织或细胞中均检测到HBV的标志物 ·HBV吸附？暂居？建立感染状态？ 依据：从上述组织细胞中检测到cccDNA， 但必须解决检测技术问题 * * 一、几个相关问题简介 乙型肝炎病毒基因组结构示意图 乙型肝炎病毒的复制过程 我们为什么要关注HBV cccDNA? ? cccDNA存在于细胞核内，成为乙肝病毒的复制“池” ? 目前尚没有可以进入细胞核内，并能够清除cccDNA 的药物，这也是现有抗病毒药物治疗效果不佳和治 疗后容易复发的原因之一 ? 肝脏以外器官组织细胞可能存在cccDNA，成为肝脏 移植术后乙肝复发的来源 ? 还没有稳定、可靠、敏感的cccDNA检测试剂盒问世 为什么没有cccDNA检测试剂盒问世? ·研究和开发该检测技术的时间不长 ·检测技术上的难度较大 ·前期研究主要集中于细胞模型和动物肝脏 模，不能满足临床检验的需求 ·现有技术灵敏度不高，检测低限104 copy /ml左右 ·分研究机构和学者对检测技术的特异性认 识不足，存在缺陷 ·多种同源的乙肝病毒DNA分子并存(cccDNA、 rcDNA、ssDNA、整合的HBV DNA），必须有 效地分离cccDNA和其他类型的病毒DNA ·如何进一步解决特异性的问题？ ·如何解决灵敏度不高的问题（细胞内cccDNA 含量的较低），血清中含量？ ·如何简化检测步骤？ 建立cccDNA检测技术必须克服的难点 弱，容易被降解 强，不容易被降解 对某些核酸酶抗性 共价结合 不结合 是否与蛋白质结合 松弛环状，非超螺旋 闭合环状，超螺旋 核酸空间结构 两条链均不