荧光定量PCR原理、应用及Stratagene Mx3000P介绍幻灯片.ppt

内 容 提 纲 荧光定量PCR原理及应用 Stratagene Mx3000P荧光定量PCR仪 常规核酸定量方法 Southern 杂交 Northern 杂交 原位杂交 传统 RT-PCR 半定量 PCR 实时荧光定量PCR 定义 利用荧光信号对PCR反应的过程进行实时监控 目的 对起始模板进行定量 优点 灵敏, 重复性, 动态范围宽, 高通量 原理 C(t)值与起始模板浓度的对数成反比 什么是C(t)值 C(t)值与起始模板的关系 为什么要引入C(t)值 实时荧光定量 如何定量 常用的荧光试剂 SYBR Green ITM TaqMan? / TaqMan-MGB? Molecular Beacons MGB EclipseTM Probes Lux? primers ScorpionsTM Amplifluor Q-Zyme Others... 荧光定量PCR应用 特异核酸（基因）定性、定量 RNA (cDNA) 基因表达差异分析 基因芯片结果验证 DNA 病原体定性与定量 GMO (遗传改良组织)检测 序列特异性 等位基因分型, SNP 检测 应用之一：病原体检测与定量 应用之一：病原体检测与定量 应用之一：病原体检测与定量 两条探针分别针对不同等位基因 应用之四：GMO检测 应用之四：GMO检测抗除草剂的转基因大豆 应用之四：GMO检测 检测策略 抗性EPSPS基因的量 转基因大豆的量 Lectin基因的量 食品中大豆总量 荧光定量PCR仪的硬件条件 荧光定量PCR仪应满足的要求 光源的光谱范围宽广，能激发不同的荧光染料 能分开不同荧光素的激发光与发射光波长 能检测的灵敏度与动态检测范围 准确的温度控制和良好的孔间温度均一性. 荧光定量PCR原理及应用 Stratagene Mx3000P荧光定量PCR仪 Mx3000P 整体设计 Mx3000P 热循环系统 96 孔样品槽 半导体加热制冷 温度均一性: +/- 0.25°C 升降温速率: up to 2.5°C/sec 热循环系统 Mx3000P 光路系统 Mx3000P 光学系统 石英卤钨灯(350-750nm) 2 个滤镜轮 可选择的滤镜: Filter sets: FAM/SYBR, HEX/JOE/VIC, ROX/Texas Red, Cy5, Alexa350, TET, NED/TAMRA, Cy3 1 PMT（光电倍增管）检测器 350-700nm 发射光检测范围 扫描式检测设计 Mx3000P 扫描系统 整板扫描3.5s 滤镜轮旋转进行多通道扫描 激发光源的比较 Lasers: 光强高, 波长范围窄； 石英卤钨灯: 中等光强, 波长范围宽； LED: 光强低, 波长受限制。 Mx3000P 可用荧光染料 荧光滤镜系统 四通道设计，避免光谱重叠 荧光检测系统灵敏度比较示意图 PMT与CCD的检测原理 CCD与PMT检测区别 CCD与PMT检测结果均一性对比 Mx3000P均一性实验 利用FullVelocity? 技术提高PCR运行速度 最新的工程聚合酶 Archaeal (non-Taq) DNA polymerase 同样具有优越的: 灵敏度 特异性 可重复性 Mx3000P 软件 易学易用 各种数据分析方式：自动分析或者手动分析 支持荧光定量PCR的多种应用模式 多种应用模式 软件的结构 PCR程序设定 实时扩增数据 标 准 曲 线 相对定量Results Display 基因分型结果显示 结果文本显示 Text Report or raw data can be exported to Excel or a text file Brilliant? QRT-PCR and QPCR Reagents Master mixes and reagent kits for any fluorescent chemistry Compatible with sequence-specific probes SYBR Green kits Brilliant? SYBR? Green QPCR Reagents Brilliant? Probe-based QPCR Reagents 引物探针设计软件 独特优点 能高效设计双标记探针(Taqman,FRET探针,分子信标等) 优化的引物设计能适应不同的荧光定量PCR方法 能进行等位基因分析与多重定量PCR探针设计 有二级结构分析功能,能图形化显示各种位置与结构 内置BLAST连接 Fast Track QPCR 培训项目 优势： 快速有效的