宿主细胞dna残留检测技术培训手册-湖州申科生物技术有限公司.pdf

中国科学院上海生命科学研究院湖州营养与健康产业创新中心 宿主细胞DNA 残留检测 技术培训手册 年 月 2016 12 中国科学院上海生命科学研究院湖州营养与健康产业创新中心 湖州申科生物技术有限公司 中国科学院上海生命科学研究院湖州营养与健康产业创新中心 目录 1. 使用范围1 2. 残留DNA （rDNA）检测必要性1 2.1致瘤性1 2.2传染性1 2.3DNA 整合2 3. rDNA 检测2 3.1rDNA 限量规定2 3.2rDNA 检测方法4 3.3 检测方法发展趋势7 3.4 样品前处理方法8 3.5SHENTEKrDNA 检测试剂盒介绍9 4. 标准术语9 5. rDNA 样本12 5.1 典型取样点12 5.2 样本运送和保存13 6. rDNAqPCR 检测实验13 6.1 实验要求13 6.2rDNA 检测试验流程15 6.3 样本准备16 6.4rDNA qPCR 检测数据分析：17 7. rDNA 检测方法学验证19 7.1 验证项目19 7.2 分类19 7.3 方法学验证举例21 7.4 特定样品的方法学验证22 8. 注意事项23 9. 常见问题24 10. 参考文献25 技术服务咨询：27 中国科学院上海生命科学研究院湖州营养与健康产业创新中心 1. 使用范围 本手册由中国科学院上海生命科学研究院湖州营养与健康产业创新中心和湖州申 科生物技术有限公司编写，为宿主细胞DNA 残留检测方法的建立提供全面指导，供生 物制品生产及研发企业等人员参考。 2. 残留DNA （rDNA）检测必要性 随着生物医药技术的飞速发展，生物制品的表达系统一直在改变。除了一些常见的 细胞系，如CHO、E.coli、酵母等之外，细胞系如植物、昆虫以及人的细胞越来越广泛 应用于治疗性疫苗和治疗性生物制品生产中。生物制品包括重组蛋白，疫苗，以及特殊 的单克隆抗体。 源自细胞及微生物培养生产的生物制品含有特定杂质，包括宿主细胞蛋白 （HCP） 及DNA 残留（rDNA）。相关研究表明，生物制品中宿主细胞rDNA 具有潜在致瘤和传 染风险，rDNA 还可能造成基因插入突变，因此检测rDNA 的含量关系到生物制品的质 量与纯度，是产品质量的一个重要指标，更是一个安全性问题。 2.1致瘤性 人体内的原癌基因正常情况下参与细胞进程，而一旦被激活 （如突变），原癌基因 则变成活化的癌基因。而这种被激活的癌基因常存在于特定细胞的基因组中，如连续传 DNA HIV Ras 代细胞系和成瘤细胞 （残留 可能携带 病毒或 癌基因等）。研究表明，分 布在哺乳动物细胞基因组的LINE-1序列可能发挥逆转录转座子作用插入到染色体中， 这种插入可能影响关键基因功能的发挥，如激活癌基因或抑制抑癌基因。 2.2传染性 残留DNA 的感染性是由于细胞DNA 中可能存在传染性病毒基因组，该基因组无论 是作为染色体外组分还是整合入人体基因组，都能够扩增并产生传染性病毒粒子，因此 DNA 感染性风险可能比致瘤风险更大。对于肿瘤来源的细胞基质，尤其是活病毒疫苗， rDNA 应作为安全性评价的一个指标。 1 中国科学院上海生命科学研究院湖州营养与健康产业创新中心 目前的研究结果显示，残留DNA 的致瘤性相比传染性风险要低，但考虑到致瘤性 实验是动物实验，传染性实验是在细胞水平做的，或许对两方面的风险都不能掉以轻心。 2.3DNA 整合 DNA 整合入人体基因组，然后通过激活原癌基因或失活抑癌基因致瘤，这种可能性 理论上是成立的，而这种风险存在与否取决于整合的DNA。研