第2章-蛋白质-WJ.ppt

凝胶过滤层析法 按蛋白质电荷大小不同的分离 A. 电泳法： 不同蛋白质颗粒所带电荷性质，电荷数量以及分子大小和形状等不相同，所以不同的蛋白质有不同的迁移率（当蛋白质不是处于等电状态时，它必定带正或负电荷，因此能在电场中向正极或负极移动泳动而达到分离各种蛋白质的技术）。 　　　蛋白质受到SDS处理后，肽链间的连接完全解开，每条肽链能与大量SDS结合而带上很强的负电荷，在SDS凝胶上进行电泳时，它的迁移率决定分子量大小，即分子量的对数与相对迁移率成直线关系。 十二烷基硫酸钠(SDS)凝胶电泳法 SDS－PAGE电泳 常用于蛋白质分子量的测定 B. 离子交换层析： 是一种以离子交换树脂作支持剂层析法。利用蛋白质具有酸碱性质的特点，以阳离子(或阴离子)交换树脂柱进行层析分离蛋白质。由于不同物质与树脂间的静电吸引不同，使不同物质按亲和力大小顺序依次被洗脱下来而得到分离。 按蛋白质生物化学性质--亲和层析： 　　某些蛋白质与其相应的专一性配基进行特异的非共价的可逆结合。 将待纯化的蛋白质的特异配体通过适当的化学反应共价连接到琼脂糖凝胶一类的载体表面的功能基团上，当蛋白通过层析柱时，待纯化的蛋白质被吸附在配体上，然后通过特异的相应配体溶液把蛋白质洗脱下来。 琼脂糖凝胶 连接臂 配体分子 杂蛋白分子 （不被吸附） 洗涤除去 亲和洗脱 理化性质与分离技术的关系 性质 分离纯化方法 分子形状、大小 离心、超滤、分子筛层析、SDS电泳 溶解性 盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀 电荷 电泳、离子交换层析 生物化学性质 免疫电泳、亲和层析 思考题 1. 蛋白质的结构层次及其相互关系。 2. 以血红蛋白为例，论述蛋白质结构与功能的关系。 3. 蛋白质分离纯化的一般步骤及主要技术。 4. 蛋白质的各级结构、等电点、两性离子、肽键、肽平面、肽单位、盐溶、盐析、变构效应、协同效应、亚基、分子病、蛋白质变性、复性。 * * * * * * * * * * * * * * * * * 血红蛋白开始时由于氧浓度较低， 对氧的亲和力较低，曲线升高较慢。 随着氧浓度增加，结合氧增加，曲 线斜率也增加，当全部饱和后，曲线处 于水平，曲线呈“S”状。 意义：在肺部，有利于脱氧血红蛋白结合更多的氧；在肌肉中，有利于氧合血红蛋白释放更多的氧，满足肌肉中的生物氧化。 一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。 促进作用称为正协同效应 (positive cooperativity) 抑制作用称为负协同效应 (negative cooperativity) * 协同效应 (cooperativity) 蛋白质四级结构与功能的关系：变构效应 多亚基的寡聚蛋白质分子或酶中，效应剂作用于某个亚基，引发其构象改变，继而引起其它亚基构象和功能的改变，导致蛋白质或酶的生物活性的变化，这种作用称为变构效应，这样的效应剂也称变构剂。 变构效应（allosteric effect ） 蛋白质的胶体性质 蛋白质的两性性质和等电点 蛋白质的变性和复性 蛋白质的沉淀 蛋白质的紫外吸收及呈色反应 第4节 蛋白质的的重要性质 1. 蛋白质的胶体性质 分子量大，分散在溶液中颗粒大小的直径约为1~100nm，已达到胶体颗粒的尺度范围，因此具有各种胶体性质（如：不能通过半透膜）。 * 蛋白质胶体稳定的因素 颗粒表面电荷 水化膜 蛋白质的水溶液是一种稳定的亲水胶 蛋白质颗粒表面所带的各种极性基因，都和水有高度亲和性，极易吸附水，使颗粒外围形成一层水膜，使颗粒彼此隔开，不致因互相碰撞凝聚而沉淀。 蛋白质是两性电解质，在非等电点状态时，相同蛋白质颗粒带有同性电荷，使颗粒之间相互排斥，不致互相凝聚而沉淀。 2. 蛋白质的两性电离和等电点 蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。 蛋白质的等电点（isoelectric point）：当溶液在某个pH时，使蛋白质分子所带正负电荷数恰好相等，即净电荷为零，在直流电场不移动，此时溶液的pH就是该蛋白质的等电点，用pI表示。 ★ 两性解离物质所带净电荷为零时溶液的pH。 蛋白质的等电点 蛋白质在等电点时溶解度最小： 　　　由于等电点时蛋白质颗粒上所带净电荷为零，颗粒在溶液中不存在因带相同电荷而互相排斥，因而颗粒间容易互相碰撞而凝集沉淀。 3. 蛋白质的变性与复性 蛋白质变性 (denaturation): 　　　在某些物理和化学因素作用下，蛋白质分子的特定空间构象被破坏，从