实验二电泳幻灯片.pptVIP

实验顺序 1 取胶，水清洗一次 2 取NC膜，漂浮于水面2分钟，侵入水中2分钟 3 装配“三明治”，电转印。 4 配试剂…… 兰州大学生命学院 沈 喜 2012.5 第二部分 免疫印迹分析 一、实验原理 人类免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）根据其重链稳定区的分子结构和抗原特异性的不同，分为五类：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE。其中IgG占血清免疫球蛋白总量的70%～75%。 大多数抗菌性、抗毒性和抗病毒抗体属于IgG，它在抗感染中是主力军。患变态反应性疾病、自身免疫性疾病、各种感染以及多发性骨髓瘤等时，免疫球蛋白可异常增高。患获得性免疫缺陷综合征等免疫缺损病时免疫球蛋白可异常降低，临床上常应用免疫球蛋白制剂防治传染病、某些肿瘤和免疫缺损病等。 人的IgG由两条重链（heavy chain, H链）和两条轻链（light chain, L链）组成，H和L链上有可变区（variable region,V区）和恒定区（constant region,C区），它们之间以二硫键相连。在加SDS的电泳条件下，分子中的二硫键被还原成游离的巯基，四条链分开，重链迁移速度较慢，轻链迁移速度较快，可跑出两条带。 特异性抗体检测相应抗原条带 酶标二抗 第一抗体 被测抗原 封闭物 电泳分离的蛋白质转印到硝酸纤维素膜上，不同的几何形状代表不同种类的蛋白质。一抗(兔抗人IgG )识别人IgG重链并与其结合，再用过氧化物酶标记的二抗(羊抗兔IgG )与一抗结合，最后加入过氧化物酶的底物，酶催化底物产生有色、不溶性的产物，沉积在人IgG的重链带上。根据颜色的深浅和面积，可以估计被测蛋白的量。 信号放大作用 间接检测法： 二级抗体可测定多种多样的一级抗体从而避免了逐一标记一级抗体; 一抗通常能与几个二抗分子结合，从而起了信号放大的作用。Western印迹法检测蛋白的敏感 性为1-5ng。 缺点：是一抗可能会与二抗发生交叉反应，产生非特异性条带；检测过程增加了额外的温育步骤。 二、实验目的 通过蛋白质标准曲线求出IgG重链的分子量 检测人体患病状态下IgG蛋白含量的差异 两个胶条分别处理 宽胶条 考马斯亮蓝R250染色 窄胶条 转印后免疫染色 人血清 标准蛋白 人血清 三、实验步骤 染色、脱色 将宽胶条放到培养皿中，用蒸馏水清洗后，加入约10ml考马斯亮蓝R-250染色液染色1小时左右，然后换成脱色液脱色，不时摇动。更换几次脱色液，至背景无色透明，条带清晰为止。 制备“转移三明治” 1.切割与胶尺寸相符的硝酸纤维素膜，用转移缓冲液或水浸泡5min使之湿润。 2.准备2张滤纸和海绵一起浸泡在转移缓冲液中。 3.打开转移槽的胶板，依次放入： a.一张浸湿的海绵。 b. 一张浸湿的滤纸。 c. 用转移缓冲液冲洗过的胶，并小心地赶走滤纸和胶之间的气泡。 d. 硝酸纤维素膜，在膜的右下角剪一小角，以标明电泳方向。 e. 一张浸湿的滤纸。 f. 一张浸湿的海绵。 转移电泳槽的夹板 转 移 . 小心地合上胶板，按胶侧为负极，膜侧为正极的方向放入转移电泳槽中，加转移缓冲液至满。 转移电泳装置 插好电极，打开电泳仪开关调至稳压60V，电泳1h，转移结束后打开胶板取出硝酸纤维素薄膜。目标蛋白质越大，时间越长 膜的酶联免疫染色 1、封闭：用TBS缓冲液洗膜1min后，将膜封入塑料薄膜袋内，留一开口。加封闭液1ml(0.2ml/cm2)后封闭开口，37℃摇床上摇动30-50min。 封口机的操作 加热指示灯 加热时间调节旋钮 加封闭液及抗体 2、与第一抗体结合 (1)弃封闭液，加入适当稀释的1ml第一抗体溶液(兔抗人IgG)，封口后37℃摇床上轻轻摇动50min。 (2)取出膜，用TTBS洗膜3次，每次1min。再封入一新的塑料薄膜袋内。 加入封闭液后的塑料袋 一抗反应 二抗反应 3、与酶标第二抗体结合 (1)加入适当稀释的1ml辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG，37℃摇床上轻轻摇动50min。 (2)取出膜，用TTBS洗3次，每次1min，最后用TBS溶液洗1次，以去除Tween-20。  4、加底物溶液显色 将膜浸入10ml底物溶液中，至显色清楚后，用水清洗，以除去多余的底物。转入水中保存。 四、结果分析 在凝胶成像分析系统上照相，并分析结果。测量分子量标准蛋白的迁移距离，作出标准曲线，再测出硝酸纤维素膜上的人IgG条带的迁移