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菌种保藏和使用技术 马鞍山丰原制药有限公司 胡益宏 药品微生物检验常用标准菌株 枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis [CMCC（B）63 501] 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus [CMCC（B）26 003] 生孢梭菌 Clostridium sporogenes [CMCC（B）64 941] 铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa [CMCC（B）10 104] 大肠埃希菌 Escherichia coli [CMCC（B）44 102] 白色念珠菌 Candida albicans [CMCC（F）98 001] 黑曲霉 Aspergillus niger [CMCC（F）98 003] 菌种编号 CMCC —— 中国医学菌种保藏中心 CMCC（F）或 CMCC（B） B —— 代表细菌、F ——代表真菌 ATCC ——美国标准菌种收藏所 著名的微生物保藏中心，创立于1899年，设在美国马里兰州罗克维尔市。收藏有细菌、真菌、动植物病毒、噬菌体、藻类和原生生物等共计16000株以上的微生物种株。 菌种的采购 每年按计划，由实验室菌种管理人员提出菌种采购的计划，计划购置的菌种一般为药典收载的标准菌种，填写请购单，经批准后，由所采购部门向指定的菌种保藏机构购置。 所购菌种一般为冷冻干燥菌种 ，黑曲霉为菌悬液。 采购部门购入菌种后，应及时移交实验室。实验室菌种管理人员应仔细核对菌种发放单和菌种管标签等各项信息，确认无误后，置-20℃保存。 菌种的复苏 菌种在打开前应仔细核对标签上菌名、菌号。并注意一株菌种使用一套打开用具，严防交叉污染。 菌种复苏应在生物安全柜内操作。 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌和白色念珠菌可同时接种液体培养基和琼脂培养基斜面，黑曲霉只能接种琼脂培养基斜面。 取琼脂培养基斜面上的菌苔按要求对菌种的纯度进行鉴定。 干菌种(安瓿)的开启： 菌种的传代 应在生物安全柜中进行菌种的传代 。 取经过纯度鉴定的第1代菌种管（琼脂培养基斜面培养物）用于传代制备第2代菌种。 接种完毕，液体培养基或琼脂培养基斜面应在规定的温度下培养适宜的时间，白色念珠菌培养24-48小时，黑曲霉培养5～7天，其它菌种一般培养18～24小时。 斜面接种时的无菌操作 菌种保藏及应用参考方法： 干菌种（0代）→ 100ml液体培养基复苏（1代） → 100ml液体培养基复壮（2代）→ 加100ml 20%无菌甘油混匀，1ml/管冻存管分装，-20℃或-80℃保存。每次使用取1支自然（室温）解冻，取0.1ml接种至10ml液体培养基（生孢梭菌用12ml硫乙醇酸盐流体培养基）按规定培养、稀释（3代） 在冷冻前，应贴上菌种标签。标签内容应包括菌名、菌 号、传代日期和有效期。 所有冻存管应立即置低温冰箱中，迅速冷冻。 菌种的使用和销毁 检验工作所需菌种，领用人应向菌种管理人员领取，并在《菌种传代使用记录》上记录菌名、代数管号、领用日期、领用人等信息。 过期菌种应及时销毁，销毁时应经121℃ 30分钟的生物灭活处理。 菌悬液制备后应在2小时内使用，若保存在2～8℃的菌悬液可以在24小时内使用。黑曲霉也可制成稳定的孢子悬液保存在2～8℃，在验证过的贮存期内替代对应量的新鲜孢子悬液使用。 参考菌液制备标准程序： 取经35℃培养18-24小时的枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌与大肠埃希菌的营养肉汤培养物1ml，加入9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，分别10倍稀释备用（枯草芽孢杆菌至10-5、金黄色葡萄球菌10-6、铜绿假单胞菌与大肠埃希菌至10-7）； 标准菌种实验用菌液 参考菌液制备标准程序： 取经35℃培养18～24小时的生孢梭菌硫乙醇酸盐流体培养物1ml，加入9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-7备用； 标准菌种实验用菌液 参考菌液制备标准程序： 取经25℃培养18～24小时的白色念珠菌改良马丁培养物1ml，加入9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-5备用； 标准菌种实验用菌液 参考菌液制备标准程序： 取经25℃培养一周的黑曲霉菌改良马丁琼脂斜面培养物，加0.9%无菌氯化钠溶液5ml，洗下孢子，转移至另一空管，加0.9%无菌氯化钠溶液至与标准比浊管浊度相当后，取1ml加入9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-4备用。 标准菌种实验用菌液 关于黑曲霉： 标准菌种实验用菌液 关于黑曲霉： 菌种鉴定 简单的讲可以采用目前