第五章 细胞破碎、蛋白质复性和固液分离.pptVIP

?#? 3 ?#? 4 * 特性应该指：性质（温度，pH，电荷，稳定性等），包括来源，各种杂质的不同所采用的去除方法也不相同。 * 纯化精制将在后面各章作为重点学习，前面主要讲述初级过程； 包含体的溶解和蛋白质的复性是基因工程产品成功提纯的关键。 * DTT 二硫苏糖醇，GSH 谷胱甘肽，β－ME： β－巯基乙醇 * * 该膜具有挡住90%或95%的该分子量标准试验物的能力—MWCO，超滤膜常用规格：1万MWCO、10万MWCO、30万MWCO；微孔膜常用规格：0.2μm、0.45μm、0.6μm。 * 缺点： 造价高； 过滤面积小； 表现对蛋白质一定的吸附； * 刮刀卸料工业用离心机（--张家港华大离心机公司） 主电机带动套装的内外转鼓全速旋转，物料由进料管引入转鼓，在离心力作用下，液相物穿过滤布和内转鼓壁滤孔排出内转鼓，汇集到内外转鼓间的间隙内，穿过到虹吸室的通孔进入虹吸室，再由虹吸装置抽走排出机外。固相物截留在内转鼓形成环形滤饼层。进料达到预定容积后停止进料，进一步分离，此时可进行洗涤。洗涤、分离结束，刮刀自动旋转，将固相物刮下经输料螺旋排出机外，然后自动洗网，开始下一个循环。 二、微孔膜过滤 根据流体各组分尺寸大小的不同，利用高分子聚合膜，过滤分离微米级的细胞、细胞碎片和生物大分子的过程。 何谓微孔膜过滤？ 切割分子量? MWCO 微滤（0.1~10μm)：分离固体颗粒 超滤（0.001~0.1μm)：浓缩大分子物质 反渗透（0.001μm)：从小分子中脱除水分 微孔膜过滤的3种方式： 缺点： 技术难以掌握，影响因素多； 稳定性和重复性不好； 膜堵塞问题难以解决！ 微孔膜过滤特点 优点： 容易做到封闭式操作，不受环境污染 设备投资少，操作安全； 加工量可大可小，十分方便； 有利于分离密度差小而难以离心的固体，可直接用于下游的层析过程。 微滤技术要点： 选择合适的膜： ①不与蛋白质、脂类等发生吸附； ②孔径合适。 不锈钢板式过滤器 不锈钢杯式过滤器 正压过滤器 机电一体式微滤过滤系统 微滤技术要点： 2.选择合适的操作条件： 过滤方程（达西公式）： V=ΔP/[μ(Rc+Rm)] V：过滤速度，ΔP：压力差，μ：滤液粘度，Rc：滤饼阻力，Rm：过滤介质（膜）的阻力。 ΔP恒定，Rc增加，V降低 保持V不变则需阻止滤饼生成或不增厚。若Rm和μ不变，则V恒定，因为ΔP增加会加大Rc。 3.膜材料的新发展——无机陶瓷膜 优点：（机械强度大、惰性更大） 孔径均匀，过滤效果好； 耐蒸气消毒、耐酸碱和有机溶剂； 坚固耐用，使用寿命长； 可以加压反向冲洗 缺点：造价高；过滤面积小；表现对蛋白质一定的吸附； 各种微孔膜柱及设备 各种微孔膜柱及设备 操作方式 切向流过滤： （悬浮液沿与滤膜水平的方向流动，因此过滤过程中不断带走堆积在介质表面的固体物质，不会形成滤饼层而使膜堵塞。 ） 一种维持恒压下高过滤速度的技术。 原理：当移走固体与固体沉积速率相同时，过滤速度就保持恒定，控制不同的切向流速度就可以得到不同的过滤速度。 Sartocon Slice整体型切向流过滤系统 德国Sartorius Vivaflow 50 回旋流/切向流超滤器 使膜相对于悬浮液运动（将膜附于圆筒上高速旋转） 切向流过滤的缺点 产生的剪切力使蛋白质产物失活，流速越快，失活越严重； 悬浮液在流动过程中有压力损失，能耗消耗大； 不能避免膜的污染和堵塞，当膜的阻力增大时，无法防止过滤速度的下降； ２、脉冲反洗切向流过滤 原理：在切向流过滤中间歇地在膜的背面加一反压，迫使部分滤液反透过膜以冲掉膜上的固体沉积和膜孔中的堵塞物，使过滤速度保持在比较高的水平。 ３、调整生化悬浮液的性质 调整pH值和离子强度； 加入絮凝剂； 加入过滤助剂（硅藻土系列） 三、双水相萃取 原理：利用被提取物在二相中的分配不同实现分离目的。由于蛋白质在有机相中容易失活，因此采用的二相均为亲水相，如PEG/葡聚糖、PEG／无机盐等，称为双水相，两相密度不同，轻相富含一种高分子，重相可能富含另一高分子，细胞碎片和蛋白质在二相间的分配系数不同，从而实现分离的目的。 清除细胞碎片比一般离心和过滤法优越。 PEG? (聚乙二醇) 双水相萃取的一般考虑 一般的原则：将碎片分配在下层(调节ＰＥＧ和无机盐浓度比例，可以控制细胞碎片在上下层间的分配)，其好处有： 核酸等大部分杂质一般处于下相，可以一并除去； 下相是无机盐富集相，作为废弃物成本低些； 蛋白质保持于上相的ＰＥＧ层有利于其活性的保持； 碎片在下相有利于离心机的连续分离； 双水相萃取的一般考虑 最困难的是如何使需要的蛋白质尽量集中在上相。 因此要考虑: ＰＥＧ浓度； ＰＥＧ分子量； 盐和pH值 四、泡沫分离法 表面活性