5.3细胞工程第四章.pptVIP

4.7.3 器官培养的应用举例 以软骨、神经组织、血管和肝脏的培养为例来具体介绍了器官培养。 自学内容：了解不同组织培养时培养材料的获得；培养体系（容器、培养基、培养方法）；培养结果 自学参考书：《体外培养的原理与技术》 4.7.4最新进展 正在培养的器官有指骨、人体动脉、人造肾脏 、人体乳房组织、膀胱、神经组织、人造角膜等。 我国科学家曹谊林教授1996年在世界上第一个在裸鼠背上复制“人耳”廓形软骨，2002年又完成了再造颅骨手术 4.8 干细胞 干细胞是一类具有处我更新和分化潜能的细胞。 4.8.1 干细胞的有关特性 4.8.2 胚胎干细胞 4.8.3 干细胞培养与诱导分化的意义 4.8.1 干细胞的有关特性 4.8.1.1 形态和生化特征 干细胞形态上通常呈圆形或椭圆形、体积小、核质比例大。干细胞具有较高的端粒酶活性，因此具有较高的增殖能力。 4.8.1.2 增殖 缓慢性：干细胞的增殖速度要慢于普通的可正常分裂的细胞 自稳性：干细胞会自我更新维持自身数目的恒定 4.8.1.3 分化潜能与干细胞的种类 （一）分化潜能 单能干细胞：干细胞分裂产生的子细胞只能分化为单一类型的细胞被称为单能干细胞。 多能干细胞：具有可分化出一种器官的多种组织潜能的干细胞是多能干细胞。 全能干细胞：具有无限分化潜能的为全能干细胞。 干细胞来源 成体干细胞:指成体组织内具有自我更新及分化产生1种或1种以上子代组织细胞的未成熟细胞。 胚胎干细胞：简称ES（embryonic stem ES)细胞，是一种全能干细胞，它是从着床前胚胎内细胞团或原始生殖细胞经体外分化抑制培养分离的一种全能性细胞系，可以分化成任何一种组织类型的细胞。 4.8.2 胚胎干细胞 4.8.2.1 胚胎干细胞的生物学特性与鉴定方法 4.8.2.2 胚胎干细胞的获得 4.8.2.3 胚胎干细胞的建系过程 4.8.2.4 胚胎干细胞的体外培养 4.8.2.5 胚胎干细胞的体外诱导分化 胚胎干细胞的生物学特性 ES细胞形态结构与核型 ES细胞的生长特性 ES细胞的高度分化潜能 4.8.2.1 胚胎干细胞的生物学特性与鉴定方法 ES细胞形态结构与核型 各种动物的ES细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结构。以小鼠为例：细胞体积小、核大、有1个或多个核仁。细胞中多为染色质，结构简单，散布着大量核糖体和线粒体，核型正常，具有整倍性。 不同种的ES细胞形态学特征有所不同 ES细胞的生长特性 干细胞在机体组织中的居所被称为干细胞巢，是干细胞增殖与分化的微环境。 ES细胞在体外分化抑制培养中，呈现克隆状生长，细胞紧密聚集，细胞界限不清晰，ES细胞增殖迅速，一般每18~14小时分裂增殖一次。 ES细胞的高度分化潜能 ES细胞具有全能性。ES细胞体外生长时培养在饲养层细胞上才能维持其未分化状态，一旦脱离饲养层就会自发地进行分化。 胚胎干细胞的获得、增殖和分化过程示意图 ES细胞的分化及其用途： 1、可发育为嵌合体 2、可形成组织瘤 3、可发育成为重组胚和动物个体 体外培养干细胞的基本原则：促进胚胎干细胞增殖的同时维持其未分化的二倍体状态 ES细胞的高度分化潜能 ES细胞的分化潜能评价 体外分化实验：是否分化为各类型细胞 体内分化实验：是否有组织瘤及三个胚胎层组织 嵌合体形成：是否形成嵌合体动物 核移植：核移植后观察是否正常发育 ES细胞的鉴定 碱性磷酸酶（AKP）染色：未分化的ES细胞中含有AKP且活性高，已分化的ES细胞呈弱阳性和阴性 特异性表面抗原（SSEA-1）免疫荧光标记：ES细胞表面可以检测到特异性表面抗原 4.8.2.2 胚胎干细胞的获得 胚胎干细胞的来源为早期胚胎内生细胞团或原始生殖细胞。哺乳动物早期胚胎的发育属于调整型，每个胚胎细胞都具有全能性。由胚胎细胞建立ES细胞系的原理就是将囊胚期的内细胞团或桑椹胚在体外培养，并设法阻止其分化。 从早期胚胎的获得 不同动物胚胎发育在速度上存在差异，因此对于不同动物选择胚胎的发育时机是不同的。 胚胎处理方法： 1、缓着床 2、分离囊胚内细胞团（ICM）细胞 3、脱带处理 4、离散卵裂球 胚胎干细胞的获得（以猕猴为例） 1、猕猴囊胚的获得 2、鼠胚成纤维细胞的制备与培养 3、猕猴胚胎干细胞的分离与培养 4、猕猴胚胎干细胞核型分析 5、猕猴胚胎干细胞鉴定 6、猕猴胚胎干细胞分化能力分析 从原始生殖细胞中获取 原始生殖细胞的获得主要取原始生殖细胞移动到的相应组织 具体时间依物种不同而定 获取方法（以牛胚儿为例） 1、牛胚儿及其处理 2、细胞离散与传代培养 3、鉴定与分化潜能分析 4.8.2.3胚胎干细胞的建系过程 2、ES细胞