毕业论文--棕榈肽抗菌效果研究.docVIP

棕榈肽抗菌效果研究 摘要： 通过培养皿清除区域测试以及最小抑制浓度测试来评价棕榈肽蛋白水解物对革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌的抑菌效果。分别用胰岛素和胃蛋白酶培养蛋白水解物。单独针对蜡样芽孢杆菌培养皿清除区域测试中，胰岛素溶剂（TH)和胃蛋白溶剂水解物（PH）都显示出的抑效果。TH和PH的最小抑制浓度分别为800μg/ml和2400μg/ml。通过两性离子缓冲剂SDS技术测试得知棕榈肽显现抑菌作用的分子量均低于30kDa。棕榈肽中富含对抑菌起关键作用精氨酸关键词：棕榈肽蛋白水解溶液；抑菌作用；蜡样芽孢杆菌；两性离子缓冲剂 SDS 引言 近年来，为了减小对人工化学防腐剂的依赖，食品工业压力越来越大，与此同时，由于病原微生物对各种抗生素的抗性不断增强，人们将兴趣转向使用自然非传统材料。许多报道大量有机体中低分子量生物肽的特性（zasloff 2002）。许多学者研究表明抗菌肽与常用的抗生素有协同作用，与多药抗生素有拮抗作用（spellberg et al.2004）。因此，尽管肽不能被单独利用，但是他们能够与现有的抗生素组成联合体并提高的性能。 抗菌肽通过不同的方法来实现它们的灭菌效果。无论，最初与细胞内外膜的反应是不可或缺的。抗菌肽干涉膜功能导致细胞的死亡。膜的分解破裂有许多不同的因素。模型有凹形、环型孔型和地毯模型。不是所有的抗菌肽被认为能够在膜上发挥它们的主要功能。越来越多的肽被认为可以致力于细胞内部，抑制蛋白质或者细胞壁的形成，与细胞内部的DNA或RNA相互作用抑制细胞酶的活性（David et al.2006）。大量的抗菌肽被分为7类。其中一种含有独特具有抗菌效果的氨基酸成分例如，这些肽中含有高浓度的色氨酸和精氨酸残留物（Vogel et al.2002）另一肽类，即糖肽类，在抗生领域得到越来越多的青睐。 未发表的资料数据显示得知，PKC肽属于糖肽类。。 材料和方法 PKC蛋白的制备 棕榈 饼（PKC）被Felda Kernel products Sdn.Bhd(Pandamaran,Klang). PKC(0.2μm)蛋白原料通过1M的NaOH培养基提取一小时，温度30℃，溶剂比为1:20。对固液混合液离心分离，等电位对其上清液进行收集和沉淀（pH值为3.0-4.50）。沉淀蛋白通过离心分离冻干状态。蛋白成分通过凯氏法测定。 PKC水溶物的制备 PKC蛋白水溶物的制备方法是Niberring et al.在2001年提出。1%的干燥PKC蛋白溶液在pH值为2.0，温度为37℃时逐渐形成胃蛋白酶（1:100w/w），1%的干燥蛋白溶液在pH值为8.0，温度为37℃时逐渐形成胰岛素（1:100w/w）。小时，反应物在95℃的高温状态下5分钟后转化为非活性酶，然后迅速冷却至室温。此溶液通过超膜过滤（MWcutoff=10kDa）(Sartorius Germany)，在5种不同的水和物质中收集冻干。超过滤蛋白水解物的pH值校正到7.0±0.2，然后通过0.2μm膜厚的纤维素醋酸酯过滤灭菌消毒（Sartorius，Germany）。胃蛋白酶或者胰岛素PKC蛋白水解物中的蛋白成分测定均使用凯氏法。 培养制备 蜡状芽孢杆菌，大肠杆菌，单核细胞增生李斯特菌，鼠伤寒门菌和金黄色葡萄球菌的存储培养，物质来源于医学研究协会。菌种生长的营养物质为胰蛋白酶大豆肉汤（TSB），每四周进行一次子培养来保持菌种的活力。菌种24小时进行一次接种，接种温度为37℃。繁殖结束后，将培养基稀释至5.0 logCFU/ml左右。 灭菌效果的培养板清除区域测试 培养板的清除区域测试（NCCLS 2008）在含有营养琼脂（2.8%w/v）的无菌培养基中实施。菌种在整个盘中分散传开。无菌纸空盘（直径为0.625cm）置于琼脂的中央。10mM三盐酸缓冲液（pH7.4）加入冻干的PKC蛋白水溶物（浓度为0.5-2.0%）的其中一个盘中，而且仅仅只加入三盐酸缓冲液。在37℃的温度条件下，24小时后围绕纸盘形成一个透明环，这标志着抑菌效果的形成。 微量肉汤稀释测定 含有96孔，具有300μl容量的的无菌微量滴定板用于微量肉汤测试试验中。250μl的总容量中包含125μl的双重力度TSB，100μl的过滤水解物以及25μl的培养液（ca.5.0 log CFU/ml）来确定PKC蛋白水解物的最小灭菌浓度。微量滴定板加盖无菌盖，在37℃温度下培养24小时完成。（630nm），在0,3,6,12,24小时用分光光度计分别读取其吸光度。（VersaMax Microplate Reader）。此种微量肉汤稀释法（NCCLS 2008）一次做三个平行样进行对比研究。 三甲基甘氨酸SDS 三甲基干氨酸SDS实验方法开始于Ronald et al.（2005）。标准肽购买于GenScrip