细胞培养一-1-.pptVIP

潘建平 教授浙大医学部病原生物学系 参考书 司徒镇强、吴军正. 细胞培养. 世界图书出版公司，2007 鄂征. 组织培养和分子细胞学技术. 北京出版社，2001 程宝鸾. 动物细胞培养技术.?中山大学出版社，2006 一、细胞培养基础知识二、细胞培养准备技术三、细胞培养基本技术四、细胞培养的污染及控制五、细胞培养常见问题解答 组织（细胞）培养发展史年鉴 1878 Claude Bernard: 证明一个器官的生理系统在个体死亡以后仍然可以人工维持。? 1885 Wilhelm Roux: 在一个生理溶液中维持一块鸡胚的活性并观察其发育，从而证实该发育与鸡胚的其他部分无关。? 1887 Ross Harrison: 利用凝固的青蛙淋巴液作为培养基，在体外培养青蛙神经嵴，维持其活性达数星期，并观察到了神经纤维的生长，从而解决了神经纤维的来源问题。Ross Harrison被人称为细胞培养之父。 1910 Burrows: 率先在血浆凝块中长期培养鸡胚细胞。? 1911 Lewis: 以海水、血清、胚胎提取物、盐和蛋白胨为原料配制成了第一个人工的细胞培养液，并观察到了单层细胞的有限生长。? 1916 Rous Jones: 开创用胰酶来收获贴壁生长的细胞。? 1923-1931 Carrel: 研制T型培养瓶大规模培养细胞。 1927 Carrel Rivera: 制造了第一个病毒疫苗——牛痘疫苗。 1933 Gey: 发明了转管培养细胞的技术。 1948 Fisher: 研制成了第一个化学成分清楚的细胞培养液CMRL1006。 1952 Gey 和同事: 分离培养了HeLa细胞。 1952 Dulbecco: 发明了噬斑法，用长满的单层细胞检测病毒。 1954 Abercrombie: 观察到了体外培养细胞接触抑制的现象。 1961 Hatflick Moorhead: 发现人成纤维细胞在一定的代数之后会死亡。 1965 Ham: 配制了第一个无血清培养液。 1975 K?hler Milstein: 成功得到第一个用于单抗生产的杂交瘤细胞株。 一、细胞培养的基础知识(一)细胞培养的基本概念(二)细胞培养的应用(三)体外培养细胞的种类(四)体外培养细胞的生长方式及类型(五)体外培养细胞的生长过程(六)体外培养细胞的生长条件 细胞周期时间（time of cell cycle, Tc） 完成一次细胞周期所需要的时间 Tc的长短与物种的细胞类型有关，不同类型细胞的G1长短不同，是造成Tc差异的主要原因 测定Tc的方法 标记有丝分裂百分率法（percentage labeled mitoses，PLM） 标记有丝分裂百分率法（percentage labeled mitoses，PLM） 原理：对测定细胞进行脉冲标记、定时取材、利用放射自显影技术显示标记细胞，通过统计标记有丝分裂细胞百分数的办法来测定细胞周期。 事实上由于一个细胞群体中Tc和各时相不尽相同，第一个峰常达不到100%，以后的峰会发生衰减，PLM不一定会下降到零，所以实际测量时，常以（TG2+1/2TM）-TG2的方式求出TM。 细胞处在潜伏期时，可有运动，基本无增殖，少见分裂相。初代培养细胞潜伏期长，约24～96小时或更长，连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，仅6～24小时；细胞接种密度大时潜伏期短。 当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时，标志细胞已进入对数增生期。 判断细胞生长的指标： 对数生长期内细胞分裂活动的程度(增殖活性)可作为判断细胞生长是否旺盛的重要指标 有丝分裂指数(MI) 细胞群体倍增时间 细胞增殖活性测定： MTT法 标记核苷酸(3H-TdR)掺入法 有丝分裂指数(MI) 指培养物中分裂相数量占全部细胞数量的百分比，统计时，每瓶至少需计数1000个细胞。 一般细胞的MI约为0.1～0.5%；原代培养物的MI比继代培养物低。连续细胞系和肿瘤细胞高，可达3%－5%。 操作步骤 消化细胞，将细胞悬液接至内含盖玻片的培养皿中。CO2培养箱中培养48小时，使细胞长在盖片上。 取出盖片，按下列顺序操作： PBS漂洗3分钟→甲醇：冰醋酸=3：1固定液中固定30分钟→Giemsa液染色10分钟→自来水冲洗。 盖片晾干后反扣在载玻片上，镜检。 计算： 　　分裂指数=分裂细胞数/总细胞数×100%?? 细胞群体倍增时间 培养物中细胞数量翻倍的平均时间 公式 T＝tLog2/Log(N/No) t：从接种到测细胞数的时间 　　 N：时刻t测定的细胞数 　　 No：接种的细胞数 MTT法 反映细胞