大肠杆菌克隆载体.pptVIP

Cos质粒载体的优点： ◇容量大（可达45 kb），用于基因簇的克隆 ◇具有λ噬菌体的特性，形成的重组DNA分子可进行体外包装，并能感染E.coli细胞（在细胞内不能形成子代噬菌体颗粒，因而不能形成噬菌斑） ◇具有质粒的特性，操作简便 ◇对重组DNA分子长度具有选择性包装（30～45kb） Cosmids can carry up to 45kb of insert DNA 问题： 1.cosmid是一种人工构建的载体（） A.它具有cos位点，因而可进行体外包装 B.它具有质粒DNA的复制特征 C.进入受体细胞后，可引起裂解反应 D.进入受体细胞后，可引起溶原化反应 2.cosmid质粒中，cos位点的功能是（） A.复制起点 B.限制酶切位点 C.参与包装进入病毒外壳 D.选择标记 E.用于筛选重组子 四、细菌人工染色体Bacterial artificial chromosome ( BAC ) Derived from F plasmid, can carry inserts of about 300kb pUC质粒载体的优点: ◇具有更小的分子量和更高的拷贝数 （2.7kb, 500~700 copies/cell） ◇适用于组织化学法检测重组体，一步实现对阳性克隆的鉴定 ◇具有多克隆位点区（MCS） Common plasmid vectors can carry up to 15kb foreign DNA 问题 1.质粒具备下列特征，因此适合作为克隆载体，除了（）。 A.赋予宿主细胞某种可检测的特性 B.可通过一定的纯化步骤与宿主细胞基因组分离 C.独立复制的能力 D.可复制自身DNA以及插入的外源DNA E.甲基化防止宿主的限制性内切核酸酶对其降解 2.下列对质粒特性描述中，不正确的是（）。 A. 既能以单链环状又能以双链环状的形式存在 B. 是独立于细菌染色体DNA以外的复制子 C. 没有线性的质粒DNA D. 能够自身复制。 二 . λ载体（ Lambda vector ） 主要内容： 1. λ噬菌体的基本特点 2. λDNA作载体的优缺点和解决办法 3. λ载体 1. λ噬菌体的基本特点 1）. 是大肠杆菌温和型噬菌体 2）.大肠杆菌宿主细胞裂解释放噬菌体颗粒， 噬菌体颗粒又感染附近大肠杆菌,形成新一轮裂解周期，λ- 噬菌体悬浮液加到大肠杆菌液体培养基，37C°培养6小时，培养液由混浊变澄清，说明大肠杆菌完全被裂解。 Life cycle: ◇ lytic cycle(裂解周期） ◇ lysogenic cycle（溶源周期） 1. λ噬菌体的基本特点 3）. 噬菌斑 A. λ 噬菌体悬浮液加到大肠杆菌，和琼脂糖固体培养基，37C° 过夜。 B. 固体平板培养基出现透明斑点（噬菌斑）.噬菌斑是经过若干裂解周期形成宿主菌死亡区域。同体培养基限制，透明圈外围大肠杆菌仍能生长. 4）. 一个噬菌斑中有上百万个噬菌体颗粒，均由一个噬菌体无性繁殖所产生的，是入- 噬菌体DNA 用于分子克隆的基本原理。 5）. λ噬菌体的基因组 ◇ 48514bp，线状双链DNA ◇ 线状分子两端具有12n.t的5’-端突起的可互补的粘性末端（cohensive end，cos），该末端称为cos位点，可被λ编码的A蛋白所识别 ◇ 当λ侵入宿主细胞后，线装DNA分子借助粘性末端连接成环状分子 λDNA cos位点 cos位点 2. λDNA作载体的优缺点和解决办法 优点： ◇λDNA进入细菌细胞容易 ◇由于λ能裂解宿主细胞，因此提取DNA或基因表达产物都比较容易 ◇用λ噬菌体颗粒包装的DNA易于长期保存 缺点及解决措施 ： ◇λ头部只能容纳自身DNA的78-105%，即38～51 Kb，天然λ仅可插入2.5Kb外源DNA片段——除去所有与λ裂解无关的基因和空白区 ◇同一种限制酶有多个识别位点，不利于外源DNA插入——体内突变和建立新的克隆位点 ◇重组的λDNA分子难于直接导入宿主细胞——利用体外包装成病毒颗粒，然后通过感染的方法注入DNA 3. λ载体 λDNA 基因结构 B2区和重组基因区是λ噬菌体进入裂解周期的非必需区（~15kb），可将该区缺失或用外源DNA片段取代，对噬菌体的感染和生长都不会造成影响 LA 19.9 LacZ RA 21.9 LA Lac Bio RA Charon