荧光光度分析法简述.ppt

核黄素易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。核黄素在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为光黄素，光黄素的荧光比核黄素的荧光强的多，故测核黄素时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。  化学名：7,8-二甲基－10［(2S,3S,4R) - 2,3,4,5-四羟基戊基］苯并蝶啶-2,4（3H， 10H）-二酮  分子式：C17H20N4O6  分子量：376.36 ? 若样品激发光谱的发射波长或发射光谱的激 发波长未知，则在上述对话框中设置合适的激发 发射狭缝宽度，灵敏度，放置标样，在光度计按 键中点击 ，在弹出的对话框中选择激发光 和发射光的范围以及激发光的波长的间隔，点“Search”键，等待一段时间，由仪器给出 最优波长。 1.配制系列标准溶液???取4个 50 ml容量瓶，分别加入 1.00，2.00， 3.00，4.00 ml核黄素标准溶液，用水稀释至刻度， 摇匀。 2.扫描核黄素的最大激发波长和发射波长 对核黄素标准溶液进行荧光扫描，根据激发光谱 曲线和发射光谱曲线，确定最大激发波长和最大发射 波长。 ????? 3.标准曲线的绘制 根据上述核黄素标准溶液的荧光强度，绘制标准 曲线。 六、数据处理 八、思考题 1. 荧光分光光度计与紫外分光光度计的两点主要区别是什么？ 2. 荧光产生的机理？ 3. 荧光分光光度计的比色皿为什么四面透光？ 4.为什么荧光分光光度计入射光源和检测器的方向是垂直的？ 5.为什么不能在碱性环境下检测核黄素？ 七、荧光测定方法 1.标准曲线法 将已知量的标准物经过与试样相同的处理 后，配成一定浓度的标准溶液，并测定他们的 荧光强度，绘制一条以荧光强度和标准溶液浓 度的标准曲线，然后测定未知样的浓度。 （2）荧光猝灭法 在一般荧光分析中，荧光的猝灭现象是不 可避免的，但是我们可以利用猝灭现象，进行 荧光分析。例如一物质本身不会发光，也不会 与其它物质形成荧光物质，但它会使另外一种 会发射荧光的物质荧光强度降低，荧光强度的 下降程度与该物质的浓度成比例，此法成为荧 光猝灭法。 1.特 点 灵敏度高：测定下限0.1～0.001 μg·mL-1,比分光光度法高2～4个数量级. 仪器设备相对简单、 体积小 操作较简便 反应时间也较快 八、荧光分析法的特点及应用 生物化学分析、生理医学研究、临床检测 （1)直接测定能产生荧光的物质 带苯环 的氨基酸：色氨酸、酪氨酸、苯基丙氨酸 (2)测定能与荧光试剂反应生成荧光化合物的 物质 荧光生色团标记蛋白质，研究蛋白质 的结构；致癌物同核酸结合常引起显著的荧光 (3)荧光熄灭法测定猝灭剂 2.荧光光度法的应用 实验一 荧光法测定医用维生素B2中核黄素的含量 1.学习和掌握荧光光度分析法的基本原理和方法 2.学会使用荧光分光度计 一、实验目的： 二、实验原理 三、实验仪器 RF-5301PC荧光光度计 日本岛津公司 1.仪器介绍 拥有世界最高水平的S/N，可达到150以上。最适合高灵敏度、高分辨率测定。其主要参数和特点 ①测定范围：220~900nm ②带 宽：1.5、3、5、10、20nm ③灵敏度：S/N150 ④测定方式：定性分析、同步光谱分析、定量分析、时间过程测定。 ①打开电脑和RF-5301系统的开关，点击桌面的RF-5301的快捷图标，启动仪器的控制程序 ②从“Acquire Mode”菜单中选[Spectrum光谱]，进入光谱模式。 2.操作规程 ③从“Configure设置”菜单中选择[Parameters参数] ④扫描完成后出现的谱图 ⑤定量分析的参数设置 设置激发发射光波长，激发发射狭缝宽度，灵敏度， 反应时间，单位，浓度以及强度范围。 ⑥将装有蒸馏水的样品池放入池槽中，点击“ ”自动回零。 ⑦将第一个标准样品装入池槽中，点击 弹出如下对话框，输入标准样品的浓度 ⑧以此测完5个标准样品后，屏幕上会 出现工作曲线，也会出现标准曲线方程。 ⑨在工作曲线绘制完成后，可以定量测定未知样的浓度，点击 。然后将未知样品放入池槽中，点击 开始浓度的测定。 1. 10.0 μg·mL-1核黄素标准溶液的配制： 称取0.01g核黄素置于50mL烧杯中，以 蒸馏水溶解后，定溶于1000mL容量