第十章分子杂交1-2.pptVIP

1. 基因组DNA制备 破细胞或细胞器 物理法：超声波、匀浆器、冷冻研磨、捣碎器 生化法：蛋白酶、溶菌酶、蛋白变性剂、去污剂 沉淀核酸: 乙醇、异丙醇、NaAc、NH4Ac 蛋白酶和RNA酶降解蛋白质和RNA 去除蛋白质 酚/氯仿、SDS、蛋白酶 DNA大小: 105-107 bp 2. 酶 切 不同目的设定不同的酶切条件 一般目的基因的检测: 片段大小0.5-10 kb左右 1-5 U/mg DNA, 1-20 h 酶反应的终止: 1) 10 mmol/L EDTA 2) 65℃加热 5-15 min 3) 0.1%SDS 3. 电 泳 核酸分子量与凝胶浓度 4. 变 性 碱变性: DNA双链变为单链 断裂? 10 kb DNA片段用0.25 mol/L HCl 部分脱嘌呤后, 碱裂解, 使片段变短 v 向上毛细管转移 转移缓冲液 滤纸 凝胶 尼龙膜 滤纸 草纸 玻璃板 重物 5. 转 膜 向下毛细管转移 凝胶 尼龙膜 滤纸 草纸 凝胶 尼龙膜 滤纸 草纸 盖子 转移缓冲液 转移缓冲液 湿式电转移 * 第十章 核酸的分子杂交技术 nucleic acid hybridization 核酸 核苷酸 磷酸 核苷 碱基 核糖 嘌呤 嘧啶 核糖 脱氧核糖 A G T(U) C 一、核酸的结构与性质 一、 DNA的二级结构 磷酸 二酯键 二、DNA的变性 (denaturation) 在一定条件下，DNA双链间的氢键断裂，最后双链分开成为无规则线团，而核酸分子中的所有共价键则不受影响, 称为DNA变性。 DNA变性的常用方法： 1）热变性 2）酸碱变性：pH3, pH10 3）化学试剂：尿素、甲酰胺、甲醛 DNA变性后性质变化： 1) 粘度降低 2) 密度增加 3) A260增加：增色效应（hyperchromicity) 熔解温度 Tm: melting temperature Tm(℃)=0.41×(G+C)%+69.3 r-1.66 0.098 (G+C)%= Tm(℃)=81.5+0.41 ×(G+C)% +16.6×lgM -0.63×甲酰胺%-600/L M：单价阳离子浓度，L：双链长度（bp） 氯化铯等密度离心法 三、DNA复性与核酸杂交 分开的双链在变性条件除去后能重新按碱基互补的原则以氢键相连形成双链DNA分子，这一过程称作DNA复性(renaturation)。 根据DNA变性和复性发展的一种实验技术，就是分子杂交（hybridization)。指两条来源不同但具有同源性的核酸单链在一定条件下，根据碱基互补的原则缔结成双链分子。 杂交体: 1）DNA/DNA 2）DNA/RNA 3）RNA/RNA 杂交双方分别称为探针与待测核酸 四、探针（ probe） 指能与特定核酸序列发生特异性互补的已知核酸片断，并带有可检测的标记物 探针种类： 1）cDNA探针 2）基因组DNA探针 3）RNA探针 4）寡核苷酸探针 1）cDNA探针 2）基因组DNA探针 电泳分离 特异mRNA cDNA 双链DNA 重组 重组质粒扩增 提取、纯化 酶切 片段回收和标记 逆转录 双链探针： 单链DNA探针 通用引物 大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段 3种dNTP 1种32P-dNTP 或Dig-dUTP 限制性内切酶 将靶序列克隆于适当的M13噬菌体载体中，分离带有靶序列的单链DNA CACAATTTCACACAAC 变性凝胶电泳 markers 模板DNA 标记的DNA 标记DNA 3’端片段 3）RNA探针 多克隆位点 SP6启动子 T7启动子 将靶序列克隆于pGEM载体 限制性内切酶 SP6噬菌体依赖于 DNA的RNA聚合酶 3种NTP,1种32P-NTP 或Dig-UTP 用DNA酶I消化除去模板DNA 标记的RNA探针 SP6启动子 T7启动子 体外转录系统 4）寡核苷酸探针 1. 较短简并性较高 氨基酸序列：…Gly Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys... A T T T T A AA TT TA GC TGG AA