微生物的生长量的测定方法.ppt

液体稀释法 例如：某一细菌在稀释计数法中的生长情况如下： 本法测定的是微生物的总量。 适用于非丝状单细胞微生物，如细菌的测定。 当待测菌液浓度太大时，要经过适当稀释。使 OD值的读数在一定范围内最好。 内容： 将青霉菌接种于适宜的液体培养基中。28℃震荡培养5～7d，取定量滤纸一张，在分析天平上称重a，取出青霉菌培养物放在滤纸上过滤，沥干，然后置于80 ℃干燥箱中烘干至恒重b。 菌体的干重=b-a 微生物细胞中的DNA含量不高(如大肠杆菌约占3%～4%)，比较稳定，有人估算出每一个细菌细胞平均含DNA 8.4×10-5 ng，因而可以根据分离出样品中的DNA含量来计算微生物的生物量。 测定单位体积培养物在单位时间内消耗的营养物或O2的数量，或者测定微生物代谢过程中的产酸量或CO2量等，均可以在一定程度上反映微生物的生物量。本法系间接法，影响因素较多，误差也较大，仅在特定条件下作比较分析时使用。 * * * 主讲：李少凤 一个微生物细胞 合适的外界条件，吸收营养物质，进行代谢。 如果同化作用的速度超过了异化作用 个体的生长 原生质的总量（重量、体积、大小）就不断增加 如果各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就 会发生繁殖，引起个体数目的增加。 群体内各个个体的进一步生长 群体的生长 群体生长 = 个体生长 + 个体繁殖 个体生长 → 个体繁殖 → 群体生长 微生物的生长量的测定方法很多，可以根据菌体细胞数量，菌体体积或质量作直接测定，也可以用某种细胞物 质的含量或某个代谢活性的强度作间接测定。 在微生物学中提到的“生长”，一般均指群体生长，这一点与研究大型生物时有所不同。 描述不同种类、不同生长状态的微生物生长情况，需选用不同的测定指标。 （一）微生物细胞数目的检测法 直接法（血球计数板） 间接法（平板菌落计数法、液体稀释法、滤膜过滤 法、比浊法） （二）微生物生长量和生理指标测定法 细胞干重法；总氮量测定法；其它生理指标测定法 二、微生物纯培养生长的测定方法 原理：将1cm2×0.1mm的薄层空间划分为400小格，从中均匀分布地选取80或100小格，计数其中的细胞数目，换算成单位体积中的细胞数。 适用范围：个体较大细胞或颗粒，如血球、酵母菌等。不适用于细菌等个体较小的细胞，因为 （1）细菌细胞太小，不易沉降； （2）在油镜下看不清网格线，超出油镜工作距离。 特点：快速，准确，对酵母菌可同时测定出率，或在菌悬液中加入少量美蓝可以区分死活细胞。 （一）微生物细胞数目的检测法 1、血球计数板直接计数法 血球计数板是一块特别的厚玻璃片，玻片上有四条沟和两条嵴。中央有一短横沟和两个平台，两嵴的表面比两个平台的表面高0.1mm，每个平台上刻有不同规格的格网，中央1mm2面积上刻有400个小方格(图A)。 盖玻片 计数室 在血球计数板上，刻有一些符号和数字(图A)，其含义是：XB-K-25为计数板的型号和规格，表示此计数板分25大格； 0.1mm为盖上盖玻片后计数室的高； 1/400mm2表示将计数室面积1mm2分400个小格，每小格面积是1/400 mm2。 血球计数板有两种规格，一种是将1mm2面积分为25个大格，每大格再分为16个小格(25×16)；另一种是16个大格，每个大格再分为25个小格(16×25)。两者都是总共有400个小格。当专用盖玻片置于两条嵴上，从两个平台侧面加入菌液后，400个小方格(1mm2面积)计数室上形成0.1mm3的体积。通过对一定大格内微生物数量的统计，可计算出1mL菌液所含的菌体数（图B)。 C 两种不同刻度的计数板 计数区的结构 原液所含菌体数（mL） =每小格平均菌体数×400×104×稀释倍数 平板菌落计数法 2. 间接计数法 将待测样品进行适当稀释，取一定的菌悬液涂布平板，让微生物的单细胞一一分散在平板上 ，经适宜条件培养 ，每个活细胞就会形成单菌落，然 后将形成的菌落数乘以稀释倍数，就可推算出样品的含菌数。 特点： 简单，灵敏，适用于细菌、酵母菌、芽孢与真菌孢子等数量的测定。 不适合测定样品中丝状体微生物，如放线菌、丝状真菌及丝状蓝细菌的营养体。 样品中的稀释度控制在每个平板上菌落数在30～300个最好，过多难以计数，过少增大计数误差。 平板菌落计数法 ★技术要求：样品充分混匀，操作熟练快速（15～20 min完成操作），严格无菌操作； ★注意事项：每一支吸管只能用于一个稀释度，样品混匀处理，倾注平板时的培养基温度； 平板菌落计数法 将待测样品作一系列稀释，一直稀释到取