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第五章 人工诱发单倍体及其应用 培养对象 花药培养、花粉培养 子房培养、胚珠培养、胚培养、胚乳培养 离体受精 第一节 花药和花粉培养 一、 概述 概念 花药培养:把发育到一定阶段的花药接种在人工培养基上,使其发育和分化成为植株的过程. 花粉培养(小孢子培养):从花药中分离出花粉粒,使之成为分散的或游离状态,通过培养使花粉粒脱分化,进而发育成完整植株的过程. （二）花药或花粉培养在作物育种中的作用： （三）花药和花粉培养中雄核发育的途径 1、A途径 小孢子第一次有丝分裂为不均等分裂，形成营养细胞和生殖细胞 （1）A-V途径 由营养细胞重复分裂形成单倍体 （2）A-G途径 由生殖细胞重复分裂形成单倍体 （3）A-VG途径（E途径） 由营养细胞和生殖细胞各自独立分裂，共同形成单倍体 （4）C途径 营养细胞和生殖细胞通过核融合，形成多倍体植株 2、B途径 小孢子第一次有丝分裂为均等分裂，形成大小相近的两个细胞。然后由这两细胞连续分裂形成单倍体植株，或者核融合形成多倍体植株。 （四）花药培养与花粉培养的异同点 培养目的相同，均获得小孢子植株。 花药培养属于器官培养；而花粉培养属于细胞培养。 花粉培养没有药壁组织干扰，单倍体产量高。 二、 花药培养技术 选择花药时，一般通过镜检来确定其中的花粉是否处于适宜的发育期。 最常用的方法有醋酸洋红法。但是，某些植物的花粉细胞核不易着色，需采用焙花青-铬矾法，这种方法能将花粉细胞核染成蓝黑色。 花药预处理 大量试验结果表明，花药培养前给予一定的低温处理是十分必要的。 三、花粉培养技术 1、取材时期：四分体时期到单核早期。 2、花粉的分离： 3、小孢子纯化： 对获得的小孢子混合物进行分级过筛、梯度离心处理纯化小孢子 4、花粉的培养 1）自然散落法(漂浮培养自然释放法) ： 将花药接种在预处理液或液体培养基上，待花粉自动散落后，收集培养。 2）机械游离法 a.磁搅拌法：用磁力搅拌器低速搅拌培养液中的花药，使花粉游离出来； b.挤压法：在烧杯或研钵中挤压花药，将花粉挤出后收集培养。 花粉培养方法 1、平板培养：花粉置琼脂固化培养基上培养。 2、液体培养： 花粉悬浮在液体培养基中培养，需震荡，以利通气。 3、双层培养：先铺一层琼脂固体培养基（加入失活花药的浸提液），凝固后，在表面加入少量液体培养基培养。 4、看护培养：利用花药或花药愈伤组织释放出的活性物质促进花粉小孢子发育。 5、微室培养：利用小的盖玻片和凹穴载玻片形成微室进行花粉培养。  1、胚状体发育途径：小孢子经历胚发生的各个阶段，最后子叶展开，形成花粉植株。  1、胚状体发育途径：小孢子经历胚发生的各个阶段，最后子叶展开，形成花粉植株。 2、愈伤组织发育途径：小孢子分裂数次形成愈伤，再分化形成花粉植株。此途径产生的植株会出现变异且倍性复杂。 五、花粉植株的倍性及染色体加倍 1. 对花粉再生植株群体进行鉴定的必要性： ①体细胞干扰 ②生殖细胞的自发加倍 五、花粉植株的倍性及染色体加倍 2. 花粉植株的倍性： 单倍体、二倍体、多倍体、非整倍体 3. 影响非整倍体植株出现的频率的因素： ①植株的种类 ②接种花粉的发育时期 ③培养基中激素的浓度和种类 ④花粉植株发生的方式 ⑤愈伤组织继代培养时间长短 五、花粉植株的倍性及染色体加倍 4. 单倍体植株的鉴定 1）形态学鉴定 2）染色体分析 5. 单倍体植株的二倍化 ①小苗浸泡法 ②生长锥处理 ③培养基加倍 六、花药和花粉培养中的白花苗 白化苗的控制 花粉发育时期：花药培养中，白花苗的比例随接种时花粉发育时期的延迟而提高。 培养基成分：高浓度的2,4-D会使花粉愈伤组织分化出更多的白化苗 培养温度：当培养温度提高时，白花苗的数目也随之增加。 * 花药培养和花粉培养是获 是植物单倍体的有效方法之一 二倍体(diploid )植物其单倍体（haploid）即一倍体（monoploid ）如， 玉米 2n = 2x = 20 n= x = 10； 水稻 2n = 2x = 24 n= x = 12 四倍体(tetraploid)植物其haploid为dihaploid 如，马铃薯 2n = 4x = 48， n = 2x = 24 六倍体(hexaploid)植物其haploid为triploid 如，普通小麦2n = 6x = 42， n = 3x = 21 八倍体(octoploid)植物其haploid为tetraploid 如，草莓 2n = 8x = 56 ，n = 4x = 28 单倍体(h