第十一章基因分析的基本策略2009-临床.pptVIP

第十一章 基因分析的基本策略 基因分析方式 结构分析 DNA水平 表达分析 mRNA水平和Protein水平 功能分析 1. DNA双螺旋结构发现 Watson ＆Crick,1953 DNA测序 Sanger Sequencing Maxam Gilbert method DNA Autosequence DNA测序的意义 全基因组测序 发现新基因 检测基因突变 发现SNP 分子进化分析 分析人工重组的基因 定点突变确认 DNA分析技术 基因拷贝数分析 Southern Blot PCR(Polymerase chain reaction) 基因在染色体定位分析 FISH(Fluorescence in situ hybridization) RNA分析技术 Northern Blot RT-PCR (Reverse transcription PCR) QRT-PCR 蛋白质分析技术 Western Blot Immunohistochemistry Flow Cytometry 0 1 2 3 4 β-actin PCSK9 Western Blot 谢闵、刘录山等 Flow Cytometry Immuno-histochemical Staining Immuno- fluorescence * EMAIL:liuls2000@163.com TEL 8281297(O) 南华大学心血管疾病研究所 动脉硬化学湖南省重点实验室 刘录山 博士/教授 A=T C≡G for their discoveries concerning the molecular structure of nucleic acids and its significance for information transfer in living material The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1962 James Dewey Watson Francis Harry Compton Crick Maurice Hugh Frederick Wilkins 2.中心法则提出 Crick，1958 DNA序列测定工作原理 在四种反应体系中，寡聚核苷酸分别终止于不同位置的A、T、G或C碱基，将待测DNA片段转变成一系列放射性核素标记的单链DNA片断，并使其一端为一固定的末端，而另一端由于长度不同，成为一系列相差1个碱基的连续末端。经电泳分离，放射自显影，可直接读出DNA的序列。 1、高负荷，1块胶可测16个样品；2、机读不需放射自显影；3、安全不用同位素；4、简单迅速8-10h。 不需酶促反应，可以对寡核苷酸测序。 简便、迅速、应用广泛。 优点 类似末端终止法，所不同的是用荧光染料标记，计算机自动读出。 用化学试剂在A、G、C、T处特定的裂解DNA片段，产生一簇各种长度的短链，经过PAGE放射自显影可直读DNA顺序。 使用特异性引物与单链模板DNA退火，在DNA聚合酶作用下进行延伸反应，用ddNTP终止，用PAGE区分长度仅相差1个核苷酸的ssDNA，从而完成测序的方法。 3、DNA测序自动化 2、化学裂解法 1、末端终止法 Sanger Sequencing Maxam-Gilbert Method for their contributions concerning the determination of base sequences in nucleic acids The Nobel Prize in Chemistry 1980 Frederick Sanger Walter Gilbert Paul Berg Southern Blot Southern Blot PCR PCR凝胶电泳效果图 点样孔 Marker M 1 2 3 4 5 for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method The Nobel Prize in Chemistry 1993 Kary B. Mullis Michael Smith FISH(fluorescence in situ hybridization) Intact vs. Degraded RNA. Two μg of degraded