APR834H1N1NA基因包装信号对H5N1流感疫苗株NIBRG14的产量的影响.pdfVIP

摘 要 摘 要 历史上，全球范围内的流感病毒广泛流行，造成上千万人的死亡和巨大的 经济损失，严重威胁人类的公共安全和社会经济。自 1997 年首例 H5N1 亚型高 致病性禽流感病毒突破种间屏障感染人并致死事件以来，该病毒一直在整个东 南亚地区肆虐，预示有可能出现流感大流行病毒株。疫苗免疫接种是流感防治 的最有效的手段。 在全病毒灭活疫苗株的制备中，NIBRG-14 是世界卫生组织(WHO)推荐使用 的 一 株 H5N1 流 感 疫 苗 株 ， 其 表 面 抗 原 基 因 来 自 A/Vietnam/1194/2004(H5N1)(VN1194) ，但研究表明实验室研究表明 NIBRG-14 的抗原性、免疫原性和鸡胚生长特性均可满足其作为疫苗株的要求，但该疫苗 株在鸡胚中生长不佳， HA 抗原产量通常较低。本研究以 VN1194 毒株的 NA 基因为研究对象，以提高疫苗株产量为目的，证明了包装信号的恢复能够有助 于提高病毒产量。 我们研究发现，在 PR8 背景下，VN1194NA 基因被包装入重组病毒中的效 率仅为正常包装量的 38%-68%，因此推测有一部分重组病毒为不含有NA vRNA 的缺陷型病毒粒子.我们在VN1194 NA 基因完整 CDS 的5和 3两端嵌合 PR8 NA 基因包装信号序列(vRNA 3末端 41bp ，5末端 67bp)，通过反向遗传操作成功拯 救了不同HA 和NA 组合的4 株重组病毒，分别命名为PR8HA-PR8(21/39)VNNA 、 PR8HA-VNNA 、VNHA-PR8(21/39)VNNA 、VNHA- VNNA 。 从包装效率分析，RNA 凝胶电泳直观的表明，相较疫苗株，恢复了包装信 号的病毒 NA 基因包装效率有了很大提高。通过荧光定量 PCR ，更加精确的从 分子水平证明了包装信号的添加能使 NA 的包装效率从 38%-68% 增加到 101%~103%，重组病毒中 NA vRNA 的包装效率得到完全恢复。我们以相同 EID50 接种鸡胚，每 12h 取样在 MDCK 进行滴度测定，绘制生长曲线，我们发 现恢复包装信号的病毒在鸡胚的生长滴度提高了 10 倍。从 HA 抗原产量分析， 以相同EID50 接种鸡胚，通过纯化病毒的 SDS，用BandScan5.0 分析 HA 的含量，结果表明恢复包装信号的病毒其HA 抗原含量提高了约 2.7 倍。 总之，本文就 PR8 NA 基因包装信号序列对异源 NA 基因的包装效率、重组 毒株的生长特性以及 HA 抗原含量的影响进行了探讨，为提高 H5N1 流感疫苗株 I /c17173/ 摘 要 的产量提供了解决方案，为疫苗的研制提供了新的思路。 关键词：H5N1 流感 疫苗 包装信号 病毒生长 II Abstract Abstract Worldwide pandemic influenza has caused millions and millions death and huge economic loss in human history, which threaten public sanitary and social economy. Since the first report about high pathogenic H5N1 influenza virus transmitted from avian to human and resulted in fatality, the H5N1 has been ravaging all ove