聚合酶链式反应2.pptVIP

PCR 的基本原理 其原理类似于DNA的体内复制， 在试管中的DNA的体外合成。 Denaturation（变性） template DNA (dsDNA) —— 95℃±——denaturation ——ssDNA Annealing（退火） Primer（引物）：两条寡核苷酸链；分别与待扩增的目标片段两端的序列互补。 Extension（延伸） 新合成的链又可作为下轮循环反应的模板。 尽管PCR扩增DNA非常有效，但目的DNA序列的指数扩增并不是一个无限制的过程。 在正常的反应条件下，30次循环，酶的催化反应趋于饱和----------平台效应 (Plateau) “平台效应”出现的迟早还取决于酶的性能、模板DNA的拷贝数、dNTP浓度等多种因素。 PCR反应体系与反应条件 primer 引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。 2. 保证引物中G-C比例为50%±15%，ATGC最好随机分布。 避免两条引物间或引物内部互补，特别是3’端的互补。 4. length20bp Ta（退火温度）=(4×G/C + 2×A/T – 5 °C ); length20bp Ta=62.3 °C+0.41 °C *(%GC) - 5 °C 保证每个引物的Tm值相匹配，且在70-75 °C 范围内。 5. 检测目的DNA序列看是否有错配区域，计算机程序分析可以帮助避免使用设计不合理的引物对。 (dNTPs) dNTP是dATP、dCTP、dGTP和dTTP的总称，是靶DNA 序列扩增的原料。 dNTP浓度根据靶序列的长度和组成而定， 一般使用浓度在50-200umol/L之间 buffer /Mg2+ 常用的缓冲液体系为10-50mmol/LTris-HCl（pH8.3-8.8,20℃） TaqDNA聚合酶需要游离Mg2+。 PCR反应条件 Analysis of PCR products DNA测序 2.DNA自动化测序 RT-PCR(Reverse transcription-PCR) 1.RNA preparation 2.Reverse transcription 3. PCR 4. Result Analysis:Quantification or cDNA clone Semi-Quanitify RT-PCR 1.RNA preparetion 2.Reverse transcription 3. PCR: a.Target Gene Specified primer b. GAPDH or β-actin primer 4. Quantification Sanger法测定DNA序列 方法要点 ● 基于Sanger法的基本原理 ● 用标记荧光染料的ddNTP ● 经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 ● 用荧光检测仪检测信号经计算机分析 ● 得到DNA分子序列 DNA自动测序结果举例 PCR METHODS STANDARD PCR HOT START PCR RT PCR NESTED PCR IN SITU PCR ASPCR PCR-ELISA REAL TIME QUANTITATIVE PCR HOT START PCR In hot-start PCR ，at least one reaction component,which can include the polymerase, salt (KCl or MgCl2) or dNTP(s), is withheld from the reaction until the system reaches a particular temperature. * * 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,  PCR） Kary B. MullisUSA, for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method The Nobel Prize in Chemistry 1993 PCR PCR的产物数目 以指数级方式增长 DNA片段 Cycle 1 Cycle 2 Cycle 3 Cycle N 理论上可达2n个拷贝 原料（pg） 产物(ug) 体外高效、快速、特异地扩增目的基因或DNA片段 PCR 基本原理 P