低拷贝数的质粒载体.pptVIP

用于基因克隆的载体 pBR322 是通过插入失活进行筛选的. 该质粒具有四环素抗性基因（tet r）和氨苄青霉素抗性基因（amp r）两种抗性标记。当外源 DNA 片段插入 tet r 基因后，导致 tet r 基因失活，变成只对氨苄青霉素有抗性。这样就可通过对抗生素是双抗还是单抗来筛选是否有外源片段插入到载体中。 质粒缺乏控制拷贝数的 rop 基因，因此其拷贝数达 500-700 。 pUC 系列载体含有一段 lacZ 蛋白氨基末端的部分编码序列，在特定的受体细胞中可表现 α-互补作用。因此在多克隆位点中插入了外源片段后，可通过 α-互补作用形成的蓝色和白色菌落筛选重组质粒。 载体含有LacZ的调控序列和N端146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点。当这种载体进入可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞后（质粒和宿主细胞编码的片段各自都没有酶活性），它们可以融为一体，形成具有酶学活性的蛋白质，这种现象叫α互补。由α互补而产生的?Lac+?细菌在呈色底物?5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷（X-gal）和诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）存在下形成蓝色菌落。当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，导致产生无α互补能力的氨基端片段。因此，带有重组质粒的细菌形成白色菌落。通过呈色反应即可初步识别可能带有重组质粒的菌落。 pGEM-3Z/4Z由pUC18/19 增加了一些功能片段改造而来，大小为 2.74kb GenBank 注册号为 X65304（pGEM-3Z, 2743bp）和 X65305（pGEM-4Z, 2746） 与 pUC18/19 相比，在多克隆位点的两端添加了噬菌体的转录启动子，如 Sp6 和 T7 噬菌体的启动子。 pGEM-3Z 和 pGEM-4Z 的差别在于二者互换了两个启动子的位置。 主要是利用染色体DNA和质粒DNA碱性环境中变性和复性的差异来分离出质粒DNA。 　染色体DNA 分子量比较大，在碱性环境中（高pH）变性，双链解拆开，抽提时由于机械剪切力的作用，环状断裂成线状，当pH 恢复中性时，无法恢复成环状，就呈网状与蛋白质一起通过离心沉淀下来。 　　　　质粒DNA 分子量小，在碱性环境中（高pH），双链解旋，但不拆开,当pH恢复中性时，恢复成环状。由于分子量小，所以离心沉淀时，不下沉，保留在上清溶液中。 缺点　　 SDS 破细胞很厉害，小染色体片段和蛋白质比较多，后处理较困难。 重要的大肠杆菌质粒载体 pUC18 / 19：正选择标记 lacZ’ 的显色原理 pUC18/19 Plac lacZ’ MCS b-半乳糖苷酶的a-肽段 a b 5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷 X-gal 质 粒 质 粒 重要的大肠杆菌质粒载体 pGEM-3Z： 多拷贝 装有两个噬菌体的强启动子 正选择颜色标记 lacZ’ 用于外源基因的高效表达 注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合 2743 bp MCS lacZ’ PT7 ori Apr pGEM-3E PSP6 酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如： E.coli BL21（DE3）等 注: MCS:多克隆限制性内切酶位点(Multiple clonin sites) 质 粒 质粒 质粒DNA的分离纯化 实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNA： 氯化铯密度梯度离心法 质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染 碱溶法 质粒DNA纯度底、快速、操作简便 沸水浴法 质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间 氯化铯密度梯度离心法 密度梯度离心法， 亦称平衡密度梯度离心法。用超离心机对小分子物质溶液，长时间加一个离心力场达到沉降平衡，在沉降池内从液面到底部出现一定的密度梯度。若在该溶液里加入少量大分子溶液，则溶液内比溶剂密度大的部分就产生大分子沉降，比溶剂密度小的部分就会上浮，最后在重力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子带状物。利用这种现象，测定核酸或蛋白质等的浮游密度，或根据其差别进行分析的一种沉降平衡法。 原理：在细胞裂解及DNA分离的过程上，大分子量的细菌染色体DNA容易发生断裂形成相应的线性片段，而质粒DNA则由于其分子量较小、结构紧密，因此仍能保持完整的状态。 　氯化铯-EtBr密度梯度离心法，就是根据这一差别建立的纯化质粒DNA的经典技术。当将含有溴化乙锭（EtBr）的氯化铯（CsCl）溶液加到清亮的大肠杆菌裂解液中时，EtBr扁平分子便会通过在碱基对之间的嵌入作用