高效液相色谱法（研究生）.pptVIP

与经典液相色谱法相比 颗粒极细（一般为10?m以下）、规则均匀的固定相，(键合相)传质阻抗小，柱效高，分离效率高； 高压输液泵输送流动相，流速快，分析速度快； 高灵敏度检测器，灵敏度大大提高。紫外检测器最小检测限可达10?9g，而荧光检测器最小检测限可达10?12g。 与气相色谱法相比 不受试样的挥发性和热稳定性的限制，应用范围广； 可选用各种溶剂作为流动相，对分离的选择性有很大作用，选择性高； 一般在室温条件下进行分离，不需要高柱温。 非破坏性，样品可回收。 主要类型 四类基本类型色谱法 分配色谱法（partition chromatography） 吸附色谱法（adsorption chromatography） 离子交换色谱法（IEC） 空间排阻色谱法（SEC） 化学键合相色谱法 其他色谱类型 亲合色谱法（affinity chromatography；AC） 手性色谱法（chiral chromatography；CC） 胶束色谱法（micellar chromatography；MC） 电色谱法（electrochromatography；EC） 化学键合相色谱法 以化学键合相为固定相的色谱法，简称键合相色谱法(bonded phase chromatography；BPC) 化学键合相：采用化学反应的方法将官能团键合在载体表面所形成的固定相 正相色谱（normal phase） 流动相极性小于固定相极性的分配色谱法称为正相分配色谱。 常用的分析柱有:氨基柱、氰基柱、硅胶柱。 常用流动相为极性小的有机溶剂。 适用范围：溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物 分离机制？ 分配：把有机键合层作为一个液膜看待，溶质在两相的溶解 吸附：溶质与键合极性基团间的诱导、氢键和定向作用 分离选择性： 极性强的组分k大，后洗脱出柱。 流动相的极性增强，洗脱能力增加，使组分k减小，tR 减小。 反相色谱（reversed phase） 流动相极性大于固定相极性的分配色谱法称为反相分配色谱法。 常用的分析柱有：ODS( C18)， C8， C2。 常用流动相为甲醇-水，乙腈-水。 应用：最广。非极性至中等极性的组分，（还有有机酸、碱及盐等） 保留机制疏溶剂理论（solvophobic theory） 溶质的保留主要是溶质分子与极性溶剂分子间的排斥力，促使溶质分子与键合相的烃基发生疏水缔合。 不是溶质分子与键合相间的色散力。 反相键合相色谱法 保留行为的主要影响因素 1、溶质的分子结构（极性） 极性越弱，疏水性越强，k越大，tR也越大。 同系物碳数越多，极性越弱，k越大； 引入极性取代基，降低疏水性，k值变小。 2、固定相 键合烷基的疏水性随碳链的延长而增加，溶质的k也增大。 硅胶表面键合烷基的浓度越大，则溶质的k越大。 反相键合相色谱法 3、流动相 极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的k越大 溶剂种类：水为弱溶剂，醇为强溶剂 溶剂比例：水的比例增加，使k增大 中性盐的加入：使中性溶质的k增大 pH：影响弱酸、弱减的离解 流动相的pH降低，弱酸k增大，tR增大；弱碱k变小。 流程 输液系统 输液泵应具备的性能： 流量精度高且稳定 流量范围宽 能在高压下连续工作 液缸容积小 密封性能好，耐腐蚀 Thank you！ 耐用性（robustness） 指测定条件有小的变化时，测定结果不受影响的承受程度 。 典型的变动因素有： 样品溶液的稳定性； 样品提取次数、时间； 流动相的组成和pH值； 不同厂牌或不同批号的同类型色谱柱； 柱温，流速，进样口和检测室温度等。 若条件苛刻，应作说明，为常规检验提供依据。 检验项目和分析方法验证内容： 含量、溶出度测定 精密度、准确度、选择性、线性与范围、耐用性 杂质含量测定 准确度、精密度、选择性、线性与范围、耐用性、定量限 杂质的限量检查 检测限、专属性、耐用性 鉴别 专属性、耐用性 体内药物分析:所有项目均要求. ChP(2005) 使用的色谱柱 填充剂性能 (孔径大小与使用范围) 对流动相pH要求 (一般2-8) pH?8——用高表面覆盖度键合硅胶,包覆聚合物,有机-无机杂化填充剂（ 例 ZORBAX Extend-C18 ，双子星柱） pH2——用有大体积侧链能产生空间位阻保护作用的二异丙基或二异丁基取代的C18,有机-无机杂化填充剂（例 ZORBAX SB-C18） C18,C8,-NH2,-CN ,硅胶,离子交换,凝胶, 手性键合柱. 检测器 检测器性能 对流动相要求 流动相 C18柱: 流动相中有机溶剂的比例应不低于5% UV\DAD\荧光\示差\蒸发光散射\电化学\质谱 因C18链在纯水相环境中不能保持伸展状态,易卷曲导致组分保留时间