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微生物检测之志贺氏菌检测
志贺氏菌的检验(国标法)
一、增菌称取检样25g,加入装有225mLGN增菌液的500mL广口瓶内,固体食品用均质器以8000-10000r/min打碎1min,或用乳钵加灭菌砂磨碎,粉状食品用金属匙或玻璃棒研磨使其乳化,于36培养6~8h。培养时间视细菌生长情况而定,当培养液出现轻微混浊时即应中止培养。二、分离和初步生化试验取增菌液1环,划线接种于HE琼脂平板或SS琼脂平板1个;另取1环划线接种于麦康凯琼脂平板和伊红美蓝琼脂平板各1个,于36培养18~24h。 志贺氏菌在这些培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落。挑取平板上的可疑菌落,接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体各1管。一般应多挑几个菌落,以防遗漏,经36培养18~24h,分别观察结果。下述培养物可以弃去:a. 在三糖铁琼脂斜面上呈蔓延生长的培养物;b. 在18~24h内发酵乳糖、蔗糖的培养物;c. 不分解葡萄糖和只生长在半固体表面的培养物;d. 产气的培养物;e. 有动力的培养物;f. 产生硫化氢的培养物。凡是乳糖、蔗糖不发酵,葡萄糖产酸不产气(福氏志贺氏菌6型可产生少量气体),无动力的菌株,可做血清学分型和进一步的生化试验。三、血清学分型挑取三糖铁琼脂上的培养物,做玻片凝集试验。先用4种志贺氏菌多价血清检查,如果由于K抗原的存在而不出现凝集,应将菌液煮沸后再检查;如果呈现凝集,则用A1、A2、B群多价和D群血清分别试验。如系B群福氏志贺氏菌,则用群和型因子血清分别检查。福氏志贺氏菌各型和亚型的型和群抗原见表1。可先用群因子血清检查,再根据群因子血清出现凝集的结果,依次选用型因子血清检查。4种志贺氏菌多价血清不凝集的菌株,可用鲍氏多价1、2、3分别检查,并进一步用1~15各型因子血清检查。如果鲍氏多价血清不凝集,可用痢疾志贺氏菌3~12型多价血清及各型因子血清检查。四、进一步的生化试验在做血清学分型的同时,应做进一步的生化试验,即:葡萄糖铵西蒙氏柠檬酸盐赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶pH7.2尿素KCN生长水杨苷和七叶苷的分解除宋内氏菌和鲍氏13型为乌氨酸阳性外,志贺氏菌属的培养物均为阴性结果。。必要时还应做革兰氏染色检查和氧化酶试验,应为氧化酶阴性的革兰氏阴性杆菌。生化反应不符合的菌株,即使能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集,仍不得判定为志贺氏菌属的培养物。已判定为志贺氏菌属的培养物,应进一步做5%乳糖发酵甘露醇棉子糖甘油的发酵靛基质试验志贺氏菌属4个生化群的培养物,应符合该群的生化特性。但福氏6型的生化特性与A群或C群相似。五、结果报告:综合生化和血清学的试验结果判定菌型并作出报告。
志贺氏菌PCR检测技术进展
志贺菌又称痢疾杆菌,能侵袭结肠膜上皮细胞,引起人类细菌性痢疾。按抗原结构和生化反应的不同可分为痢疾、福氏、鲍氏和宋内氏志贺菌。传统的检测方法必须经过增菌培养、分离培养和初步生化实验等步骤,操作烦琐费时。分子杂交不但技术复杂,而且克隆培养时其大质粒极易丢失和基因突变,阳性率不高。聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction, PCR),是一种体外DNA扩增技术,在体外利用模板DNA、特定的寡聚核苷酸引物和DNA聚合酶,通过DNA变性、复性和延伸过程合成一条互补的DNA链。反复重复这一过程,模板DNA就可得到大量扩增。随着微生物基因组学的发展,对志贺菌的基因结构已经清楚,1987年Buysse等[1]发现志贺菌侵袭性质粒抗原H(invasive plasmid, ipaH)存在于各型志贺菌,同时多拷贝存在于染色体和侵袭性大质粒上,不随传代而丢失。1995年,Fasano等[2]报道两种志贺菌肠毒素SHET1、SHET2编码基因。根据志贺氏菌特异性基因片段中的开放框架部分序列设计引物,可进行PCR检测。现将志贺氏菌PCR检测技术研究进展综述如下。
1 常规PCR常规PCR必须知道待扩增目的片段的序列,根据这一序列设计一对相应的引物。1998年,Islam 等[3] 以志贺菌ipaH基因序列为靶目标,设计一对引物(5′-GTTCCTTGACCGCCTTTCCGATAC-3′和5′-GCCGGTCAGCCACCCTA-3′),扩增产物为700 bp, 他们对临床上疑似菌痢的粪便标本进行检测,以PCR为金标准,培养法的敏感性和特异性分别为72%和100%。他们对123株侵袭性大肠杆菌进行PCR检测,没有产生阳性结果。常规PCR扩增后需做凝胶电泳鉴定,比较繁琐,而且扩增产物极易受到污染造成假阳性。
2 多重PCR多重 PCR 是在同一个反应管中用多对引物同时扩增几条DNA片段的方法,其反应原理、反应试剂和操作过程与一般PCR相同。由于志贺菌有4个种群,具不同的抗原基因,只针对一
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