微生物检测之志贺氏菌检测.doc

志贺氏菌的检验（国标法） 一、增菌称取检样25g，加入装有225mLGN增菌液的500mL广口瓶内，固体食品用均质器以8000-10000r/min打碎1min，或用乳钵加灭菌砂磨碎，粉状食品用金属匙或玻璃棒研磨使其乳化，于36培养6~8h。培养时间视细菌生长情况而定，当培养液出现轻微混浊时即应中止培养。二、分离和初步生化试验取增菌液1环，划线接种于HE琼脂平板或SS琼脂平板1个；另取1环划线接种于麦康凯琼脂平板和伊红美蓝琼脂平板各1个，于36培养18~24h。 志贺氏菌在这些培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落。挑取平板上的可疑菌落，接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体各1管。一般应多挑几个菌落，以防遗漏，经36培养18~24h，分别观察结果。下述培养物可以弃去：a. 在三糖铁琼脂斜面上呈蔓延生长的培养物；b. 在18~24h内发酵乳糖、蔗糖的培养物；c. 不分解葡萄糖和只生长在半固体表面的培养物；d. 产气的培养物；e. 有动力的培养物；f. 产生硫化氢的培养物。凡是乳糖、蔗糖不发酵，葡萄糖产酸不产气(福氏志贺氏菌6型可产生少量气体)，无动力的菌株，可做血清学分型和进一步的生化试验。三、血清学分型挑取三糖铁琼脂上的培养物，做玻片凝集试验。先用4种志贺氏菌多价血清检查，如果由于K抗原的存在而不出现凝集，应将菌液煮沸后再检查；如果呈现凝集，则用A1、A2、B群多价和D群血清分别试验。如系B群福氏志贺氏菌，则用群和型因子血清分别检查。福氏志贺氏菌各型和亚型的型和群抗原见表1。可先用群因子血清检查，再根据群因子血清出现凝集的结果，依次选用型因子血清检查。4种志贺氏菌多价血清不凝集的菌株，可用鲍氏多价1、2、3分别检查，并进一步用1~15各型因子血清检查。如果鲍氏多价血清不凝集，可用痢疾志贺氏菌3~12型多价血清及各型因子血清检查。四、进一步的生化试验在做血清学分型的同时，应做进一步的生化试验，即：葡萄糖铵西蒙氏柠檬酸盐赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶pH7.2尿素KCN生长水杨苷和七叶苷的分解除宋内氏菌和鲍氏13型为乌氨酸阳性外，志贺氏菌属的培养物均为阴性结果。。必要时还应做革兰氏染色检查和氧化酶试验，应为氧化酶阴性的革兰氏阴性杆菌。生化反应不符合的菌株，即使能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集，仍不得判定为志贺氏菌属的培养物。已判定为志贺氏菌属的培养物，应进一步做5%乳糖发酵甘露醇棉子糖甘油的发酵靛基质试验志贺氏菌属4个生化群的培养物，应符合该群的生化特性。但福氏6型的生化特性与A群或C群相似。五、结果报告：综合生化和血清学的试验结果判定菌型并作出报告。 志贺氏菌PCR检测技术进展 　　 志贺菌又称痢疾杆菌，能侵袭结肠膜上皮细胞，引起人类细菌性痢疾。按抗原结构和生化反应的不同可分为痢疾、福氏、鲍氏和宋内氏志贺菌。传统的检测方法必须经过增菌培养、分离培养和初步生化实验等步骤，操作烦琐费时。分子杂交不但技术复杂，而且克隆培养时其大质粒极易丢失和基因突变，阳性率不高。聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction, PCR），是一种体外DNA扩增技术，在体外利用模板DNA、特定的寡聚核苷酸引物和DNA聚合酶，通过DNA变性、复性和延伸过程合成一条互补的DNA链。反复重复这一过程，模板DNA就可得到大量扩增。随着微生物基因组学的发展，对志贺菌的基因结构已经清楚，1987年Buysse等［1］发现志贺菌侵袭性质粒抗原H（invasive plasmid, ipaH）存在于各型志贺菌，同时多拷贝存在于染色体和侵袭性大质粒上，不随传代而丢失。1995年，Fasano等［2］报道两种志贺菌肠毒素SHET1、SHET2编码基因。根据志贺氏菌特异性基因片段中的开放框架部分序列设计引物，可进行PCR检测。现将志贺氏菌PCR检测技术研究进展综述如下。 　　1 常规PCR常规PCR必须知道待扩增目的片段的序列，根据这一序列设计一对相应的引物。1998年，Islam 等［3］ 以志贺菌ipaH基因序列为靶目标，设计一对引物（5′-GTTCCTTGACCGCCTTTCCGATAC-3′和5′-GCCGGTCAGCCACCCTA-3′），扩增产物为700 bp, 他们对临床上疑似菌痢的粪便标本进行检测，以PCR为金标准，培养法的敏感性和特异性分别为72%和100%。他们对123株侵袭性大肠杆菌进行PCR检测，没有产生阳性结果。常规PCR扩增后需做凝胶电泳鉴定，比较繁琐，而且扩增产物极易受到污染造成假阳性。 　　2 多重PCR多重 PCR 是在同一个反应管中用多对引物同时扩增几条DNA片段的方法，其反应原理、反应试剂和操作过程与一般PCR相同。由于志贺菌有4个种群，具不同的抗原基因，只针对一