微生物学一微生物的培养微生物的培养是生物培养中的一种所培养.DOC

　　微生物学 　　一.微生物的培养 　　微生物的培养：是生物培养中的一种。所培养的微生物主要有霉菌、细菌、放线菌、真菌等。 　　二.激光扫描共聚焦显微镜操作步骤及注意事项 　　激光扫描共聚焦显微镜操作步骤及注意事项 　　激光扫描共聚焦荧光显微镜(laser scanning confocal microscopy,LSCM)是一种利用计算机、激光和图像处理技术获得生物样品三维数据、目前最先进的分子细胞生物学的分析仪器。主要用于观察活细胞结构及特定分子、离子的生物学变化，定量分析，以及实时定量测定等。激光扫描共聚焦显微镜可测定的样品种类很多，比如生物材料、组织(切片)、细胞爬片等。样品中荧光的来源主要有如下几种：自发荧光(autofluorescence)、荧光染色、免疫荧光、荧光蛋白、诱发荧光(induced fluorescence)及酶致荧光(enzymatically produced fluorescence)等等。其中大部分荧光素的激发和发射波长均可在仪器自带软件的染料信息库中找到。 　　1. 观察步骤及仪器操作 　　根据实验要求制备样品完毕后。即可进行观察。基本步骤如下： 　　(1)开启仪器电源及光源：一般先开启显微镜和激光器，再启动计算机，然后启动操作软件，设置荧光样品的激发光波长，选择相应的滤光镜组块。以便光电倍增管(photo multiplier tube，PMT)检测器能得到足够的信号结果。使用汞灯的注意事项同普通荧光显微镜。 　　(2)设置相应的扫描方式：在目视模式下.调整所用物镜放大倍数，在荧光显微镜下找到需要检测的细胞。切换到扫描模式，调整双孔针和激光强度参数，即可得到清晰的共聚焦图像。 　　(3)获取图像：选择合适的图像分辨率，将样品完整扫描后，保存图像结果即可。 　　(4)关闭仪器：仪器测定样品结束后，先关闭激光器部分，计算机仍可继续进行图像和数据处理。若要退出整个激光扫描共聚焦显微镜系统.则应该在激光器关闭后，待其冷却至少10分钟后再关闭计算机及总开关。 　　2.获取三维图像 激光扫描共聚焦显微镜具有细胞“CT”功能，因此，它可以在不损伤细胞的情况下，获得一系列光学切片图像。选用“Z-Stack模式，即可实现此项功能。其基本步骤是： 　　①开启“Z-Stack”选项; 　　②确定光学切片的位置及层数; 　　③启动“Start”，获得三维图像。 　　3.获取时间序列图像 共聚焦显微镜的Time-Series功能，可以自动在实验者规定的时间内按照设定的时间间隔获取图像。只需设定所需的时间间隔以及所需图像数量，开启“Start T”功能键，即可进行实验。“Time-Series功能大大减轻了实验者的劳动强度，对于荧光漂白恢复和钙离子成像等实验非常实用。 　　4. 样品要求 　　1， 样品经荧光探针标记; 　　2， 固定的或活的组织; 　　3， 固定的或活的贴壁培养细胞应培养在Confocal专用小培养皿或盖玻片上; 　　4，悬浮细胞，甩片或滴片后，用盖玻片封片; 　　5，载玻片厚度应在0.8～1.2mm之间，盖玻片应光洁，厚度在0.17mm左右 　　6，标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不能充分激发; 　　7，尽量去除非特异性荧光信号; 　　8，封片剂多用甘油：PBS混合液(9：1) 　　5.注意事项及维护保养 　　(1)仪器周围要远离电磁辐射源; 　　(2)环境无震动，无强烈的空气扰动; 　　(3)室内具有遮光系统，保证荧光样品不会被外源光漂白; 　　(4)环境清洁; 　　(5)控制工作温度在5～25℃。 　　三.病毒培养实验——传代细胞培养法 　　关于病毒培养实验，由于病毒必须在易感的活细胞内才能增殖，因此，根据不同病毒类型选择敏感动物、离体组织细胞或鸡胚进行扩增培养。 　　实验方法原理： 　　从人及动物某些组织，特别是肿瘤组织，经多次传代可建立传代细胞系，这种细胞能无限地传代，某些传代细胞对病毒敏感范围较广，可用作病毒的分离鉴定，如HeLa 细胞，Hep-2 细胞及KB 细胞。 　　三种细胞均来自人肿瘤组织细胞，HeLa 细胞来自子宫颈癌，Hep-2 细胞来自喉癌而KB 细胞来自上颚癌。由于这几种传代细胞有致肿瘤作用，目前仅用做病毒的分离鉴定及一些病毒学研究，不能用于疫苗的生产。 　　实验步骤： 　　将成片细胞的生长液倒掉，用Hanks 液洗一次。 　　加入适量的0.1～0.25% 胰蛋白酶，37 ℃孵育1 分钟。 　　将细胞倒放，细胞在上，胰酶在下，继续孵育37 ℃ 5～10 分钟。 　　将胰蛋白酶倒掉，再加入原量的生长液，用10 毫升吸管吹打分散细胞。 　　用生长液按原量3-4 倍稀释，即一瓶细胞能传3-4 瓶。 　　病毒接种及CPE 观察： 　　①取已