溪蜜柚汁胞ACTIN分离鉴定和cDNA克隆.docVIP

溪蜜柚汁胞ACTIN的分离鉴定和cDNA克隆 　　[摘要]对?溪蜜柚粒化与正常汁胞双向电泳分析,获得一个在粒化中上调表达的差异蛋白质点,经过质谱鉴定、生物信息学分析,为肌动蛋白(Actin),以?溪蜜柚粒化汁胞cDNA为模板,根据Actin氨基酸序列设计引物,进行全长的扩增,得到Actin开放阅读框包含1134碱基,编码377氨基酸。其核酸序列与黑杨派(Populus trichocarpa)、棉花(Gossypium hirsutum)、蓖麻(Ricinus communis)、圆叶锦葵(Malva pusilla) ACT的同源性在89%以上。 　　[关键词]?溪蜜柚ACTIN双向电泳串联质谱克隆 　　 　　 肌动蛋白(Actin)是真核生物细胞中普遍存在的一种重要的蛋白质,构成细胞骨架中的微丝(Microfilament)系统,参与真核生物细胞的许多重要的生命活动[1]。肌动蛋白是单一多肽链的球状蛋白质(G-actin),由375~377个氨基酸残基所组成,分子量为42kD。生物体中包含7个肌动蛋白基因,编码不同的肌动蛋白同工蛋白质。高等植物肌动蛋白在进化过程中保持高度的保守性和同源性,且具有组织和器官特异性的表达。研究肌动蛋白在拟南芥表皮毛中排列与分布时发现,肌动蛋白对细胞形态与生长极性尤为重要,在表皮毛发育过程中破坏肌动蛋白会引起表皮毛弯曲和分支[2]。Baluska等在研究拟南芥和Rye幼苗时发现,没有F-actin条件下细胞一样可以分裂,但植物会变矮,说明F-actin是细胞伸长所必需[3]。范小平等通过RNAi序列构建载体转化棉花,表明RNAi载体转基因植株棉纤维发育迟缓或受到抑制,但GhACT1只是属于影响纤维生长的多基因中的一个,而不是唯一决定棉纤维长度的基因[4]。 　　 ?溪蜜柚 (Citrus grandis (L.) Osbeck) 原产福建省平和县?溪河畔,是我国蜜柚优良品种之一,有400多年的栽培历史。柑橘果实粒化是成熟期和采后贮藏期的生理病害。其主要表现为汁胞异常膨大,变硬,汁胞木质化,风味变淡,一般情况下为囊瓣近蒂端汁胞先发生粒化,后渐向果心发展,果心处长形汁胞最为严重[5-7]。通过差异蛋白质组学研究粒化与正常汁胞,对获得的差异蛋白质点进行分离、鉴定和cDNA克隆,为从转录水平了解粒化的分子机理奠定了基础。 　　1方法 　　1.1 材料 　　 2007年9月18日,?溪蜜柚采至福建省平和县小溪村大坑果园,选择大小均匀,色泽一致、无病虫、无损伤的果实。当日从平和寄回实验室,掰开果实,液氮处理、保存、备用。 　　1.2 双向凝胶电泳 　　 取?溪蜜柚汁胞,总蛋白的提取、蛋白质含量测定及双向电泳等参照赖呈纯等(2009) 的方法[8]。 　　1.3 差异表达蛋白点质谱鉴定 　　 差异蛋白点进行脱色、胶内胰酶酶切(in-gel digestion)和肽段提取,然后进行肽质量指纹谱(Peptide Mass Fingerprinting,PMF)分析。检索数据库为NCBInr;检索种属为:all,数据检索的方式为combined;最大允许漏切位点为1;酶为胰蛋白酶。质量误差范围设置:PMF 0.3 Da,MS/MS 0.4 Da;在数据库检索时胰酶自降解峰和污染物质的峰都手工剔除[9,10]。 　　1.4 ?溪蜜柚汁胞RNA提取及总RNA含量和浓度测定 　　 取?溪蜜柚汁胞样品,参照钟凤林等方法提取RNA[11]。 　　1.5 ?溪蜜柚汁胞中ACTIN cDNA ORF的克隆 　　1.5.1 cDNA合成及引物设计 　　 按Invitrogen RT-PCR、3和5-RACE说明书中附加方案说明进行逆转录,合成cDNA。 　　 根据ACTIN [Gossypium hirsutum] (gi在蛋白的起始位置和结尾设计特异引物进行cDNA全长扩增。引物由上海博尚生物技术有限公司合成。 　　ACTR(Nco I):5- GCATA CCATGG TTAGAAGCAC TTCCTGTGGA CAATGGA 　　ACTF(Nde I):5- GCATA GTATAC ATG GCC GAT GCT GAG GAT ATT C 　　1.5.2 PCR扩增 　　 反应程序为:94℃ 5.0min,94℃ 45s,63℃ 45s,72℃1min,35个循环,72℃延伸10 min。 　　1.5.3 序列测定、序列分析 　　 胶回收PCR产物,连接、转化、涂板、筛选和PCR鉴定。菌液送上海英骏公司进行测序。序列通过Expasy、NCBI网址和DNAMAN软件进行分析。 　　 　　2结果与分析 　　2.1 差异蛋白质点APX的获得 　　 正