薄层色谱与柱色谱hym.pptVIP

一、实验目的 了解色谱法分离、提纯有机化合物的基本原理和应用。 学习并掌握薄层层析与柱层析的操作技术。 二、实验原理 色谱法亦称色层法，层析法等，是分离，纯化和鉴定有机化合物的重要方法之一。 色谱法的基本原理是利用混合物各组分在某一物质中的吸附或溶解性能（即分配）的不同，或其它亲和作用性能的差异，混合物的溶液流经该种物质，进行反复的吸附或分配等作用，从而将各组分分开。 2.1 固定相与流动相 色谱法须在两相系统间进行。一相是固定相，需支持物，是固体或液体。另一相为流动相，是气体、液体或超临界流体。 当流动相流经固定相时，被分离物质在两相间的分配，由平衡状态到失去平衡到又恢复平衡，即不断经历吸附和解吸的过程。 随着流动相不断向前流动，被分离物质间出现向前移动的速率差异，由开始的单一区带逐渐分离出许多区带，这个过程叫展层。 2.2 色谱法分类 根据组分在两相系统中的作用原理： 吸附色谱法：吸附能力的差异 分配色谱法：两相中分配系数的不同 离子交换色谱法：离子亲和力的不同 排阻色谱法：分子尺寸的大小不同 亲和色谱：利用配基、配体之间专一可逆结合性质进行物质分离的方法，为生物化学实验所常用。 2.3 色谱法分类 根据组分的分离操作条件： 纸色谱 薄层色谱 柱色谱 气相色谱法 高效液相色谱法等。 2.4 色谱法的应用 色谱法在有机化学中的应用主要包括以下几个方面： （1）分离混合物 （2）精致提纯化合物 （3）利用比移值（Rf）鉴定化合物 （4）跟踪反应进程 2.5 薄层色谱 系将供试品溶液点于薄层板上，在展开容器内用展开剂展开，使供试品所含组分分离，可用于鉴别检查或含量测定的一种实验技术，属于固-液吸附色谱的范畴。 2.5 薄层色谱 薄层板：吸附剂被均匀地涂布在玻板上，形成符合厚度要求的均匀薄层。主要有自制薄层板和市售薄层析两种类型。 点样器：一般用微升毛细管或手动、半自动、全自动点样器材。 展开容器：适用薄层板大小的专用平底或双槽展开缸，展开时须能密闭。 显色及检视：喷雾显色；浸渍显色；熏蒸显色。日光或紫外光灯下检视。 2.5 薄层色谱 操作方法 2.6 柱色谱 常用的有吸附色谱和分配色谱类。前者常用氧化铝或硅胶为吸附剂。后者以硅胶，硅藻土和纤维素为支持剂，以吸收大量的液体为固定相。 2.6 柱色谱 当加入的洗脱剂流下时，由于不同化合物吸附能力不同，因而以不同的速度沿柱向下流动，继续洗脱时，吸附能力弱的组分随溶剂首先流出。在连续洗脱过程中，不同组分或不同色带就能分别收集，从而达到分离纯化的目的。 2.6 柱色谱 （1）吸附剂 常用的吸附剂：氧化铝，硅胶，氧化镁，碳酸钙，活性炭或纤维素粉。 选择吸附剂的首要条件：不与被分离物或展开剂发生化学反应。 吸附能力与以下几点有关： （1）吸附剂颗粒大小； （2）吸附剂含水量。 2.6 柱色谱 （2）溶剂 通常根据被分离物中各组分的极性、溶解度和吸附活性等来考虑。 先将带分离的样品溶于尽量少的非极性溶剂中，从柱顶流入柱中，依次增大溶剂的极性，将不同化合物依次洗脱。 常用洗脱剂的极性：石油醚＜ 环己烷＜ 四氯化碳＜ 甲苯＜ 苯＜ 二氯甲烷＜ 氯仿＜ 乙醚＜ 乙酸乙酯＜ 丙酮＜ 乙醇＜甲醇＜ 水＜ 乙酸。 三、实验内容与步骤 1. 薄层层析法分离荧光黄和甲基橙 1）薄层板的制备 要求：表面应均匀，平整，光滑，无麻点，无气泡，无破损及污染。 2）点样： 注意勿损伤薄层表面；点样基线距底边一般不少于8mm；点间距一般不少于8mm，且不能离薄板边缘太近。 三、实验内容与步骤 3）展开 在层析缸中加入配好的展开溶剂（10%的醋酸），使其高度不超过0.5cm。 将点好供试品的薄层板放入层析缸中，上行展开（点样一端朝下，点样面朝上）。 当溶剂前沿到达规定的展距，取出薄板，晾干，待检测。 三、实验内容与步骤 4）检视及计算 日光下检视，描绘出溶剂前沿及样品斑点的位置，分别测量基线至样品斑点中心与溶剂前沿的距离，计算Rf值。 三、实验内容与步骤 2. 柱层析法分离甲基橙和亚甲基蓝 1）装柱（湿法） 取一支色谱柱，在柱子的收缩部塞一小团脱脂棉花，注意松紧要适度。 将色谱柱垂直固定在铁架台上，往柱内加适量70%乙醇溶液，打开活塞，赶走气泡。 再向柱中倒入适量70%乙醇溶液，控制滴速为1滴/秒，用小锥型瓶承接，同时通过漏斗慢慢装入15g中性氧化铝，使其逐渐沉入底部。 三、实验内容与步骤 2）加样 当溶剂的液面刚好流至滤纸面时关闭旋塞，立即用滴管加入待分离混合液1mL，尽量免待分离混合液粘附在柱的内壁上。 打开旋塞，当此溶液流至接近滤纸面时，立即用少量溶剂洗下管壁的有色物质，关闭旋塞。 3）洗脱 向柱内加入70%乙醇，打开二通活塞进行洗脱。洗脱时切勿使溶剂流干！ 三、实验内容与步骤 3）洗脱 向柱内加入70%乙醇，打开