第四章 基因工程的操作过程-课件.pptVIP

一、DNA的体外重组（切与接） 二、重组DNA分子的转化和扩增（转与增） 2、重组DNA分子导入植物细胞 4）基因枪转化法： 5）激光微束穿孔法： 6）多聚物介导法 7）花粉管通道法 3、重组DNA分子导入哺乳动物细胞 1）DEAE-葡聚糖转染法： 2）磷酸钙转染法： 3）脂质体介导法： 4）显微注射法(microinjection) 5）病毒颗粒转染法： 三、转化子的筛选和鉴定（检） 3）PCR法： 1）目的基因转录产物检测： 2）目的基因翻译产物的检测： 影响转化率的因素： 载体及DNA重组子方面 受体细胞方面 转化方法方面 1、载体及DNA重组子方面： 载体本身的性质 载体的空间构象 插入片段的大小 1）载体本身的性质： 不同载体转化同一受体细胞，转化率不同。 2）载体的空间构象： 经切、接操作后的载体DNA，因空间构象难以恢复，转化率比超螺旋结构的质粒低2个数量级。 质粒的超螺旋构象转化率最高； 3）插入片段的大小： 重组质粒分子量越大，转化效率越低。大于20kb的重组质粒很难进行转化。 2、受体细胞方面： 如：pBR322转化大肠杆菌JM83，转化率很低（103/?g DNA）；但对ED8767株的转化率则较高（106/?g DNA）。 受体细胞必须与载体匹配。 3、转化方法方面： 受体细胞的预处理 供受体的比例 转化方法 1）受体细胞的预处理： 对Ca2+转化而言，菌龄、Ca2+处理时间、感受态细胞的保存期、热脉冲时间等均为影响因素。感受态细胞在12-24h内转化率最高，分装后可在-70℃保存几个月。 感受态细胞的制备对转化率影响最大。 2）供受体的比例： 通常50-100ng的DNA对应于109个受体细胞或原生质体，加大DNA量并不能线性提高转化率，甚至使转化率下降。 DNA分子数与受体细胞数的比例对转化率也有影响。 3）转化方法： 不同转化方法的转化率不同。 Ca2+诱导转化 107 - 108 原生质体转化 105 - 106 ?噬菌体转染 107 - 108 电穿孔转化 106 - 109 三亲本杂交转化 104 - 105 方 法 转化子/?g DNA 5、转化细胞的扩增 指转化完成后细胞的短时间培养，往往与转化偶联在一起。 如：Ca2+诱导转化后的37℃培养1hr； 原生质体转化后的再生过程； ?-噬菌体转染后的30℃培养。 扩增的目的： 增殖转化细胞，以获得足量的细胞用于筛选； 扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选； 表达外源基因，便于筛选和鉴定。 根据载体遗传标记检测 外源基因产物检测 目的基因序列检测 重组率和转化率不可能达到100%的理想极限，必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子。 转化子 重组子 目的重组子 非转化子 非转化子： 转化子： 重组子： 非重组子： 非目的重组子： 目的重组子： 接纳载体或重组DNA的转化细胞； 未接纳载体或重组DNA的转化细胞。 含重组DNA的转化子； 仅含空载体的转化子。 含目的基因的重组子； 不含目的基因的重组子。 1、根据载体标记筛选： 抗药性筛选法 营养缺陷型筛选法 显色筛选法 1）抗药性筛选法： ROP ROI Sal I BamH I Tc r Pvu I Pst I Pst I EcoR I Cla I Hind III Hind II Bal I Amp r pBR322 4363 bp ori 将外源DNA片段插入BamH I、Sal I位点： 非重组子： 重组子： 可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子。 Ampr、Tcr Ampr、Tcs 将转化液涂布含Amp的平板 Amp 再将Amp平板上的转化子影印至含有Amp和Tc的平板上 Amp+Tc 影印 挑选 在Amp平板上生长、但在Amp+Tc平板上不长的转化子为重组子 基本操作： 2）营养缺陷型筛选法： 原理： 载体分子携带某种营养组份的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组份。 在不含此营养组份的培养基上长出的便是转化子。 可区分转化子与非转化子。 转化子 常见的营养缺陷型筛选标记： E.coli：常选用色氨酸生物合成基因trp，相应的受体细胞则选择trp缺陷型(trp-)。 哺乳动物细胞：常使用胸腺嘧啶