第五章 分子生物学研究方法--重组DNA技术课件.pptVIP

第五章 分子生物学研究方法简介 　 　 第一节 重组DNA技术 　　 　 　 一、重组DNA技术相关概念 　　（一）DNA克隆 克隆（clone）： 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。 克隆化（cloning）： 获取同一拷贝的过程，即无性繁殖。 分子克隆（DNA克隆） 细胞克隆 个体克隆（动物或植物） 　 　 DNA克隆： 　　 应用酶学的方法，在体外将各种来源的 DNA与载体DNA结合成具有自我复制能力的 DNA分子，继而通过转化或转染宿主细胞， 筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行 扩增、提取获得大量同一DNA分子。又称基 因克隆或重组DNA。 　 　 基因工程： 　　 实现基因克隆所采用的方法及相关 的工作，又称为重组DNA技术 (recom-binant DNA technology)。 　 　 （二）工具酶 　　 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶I 逆转录酶 DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶 　 　 限制性核酸内切酶 　　（restriction endonuclease） 　　识别DNA的特异序列，并在识别位 点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。 　　 是细菌内存在的保护性酶。分为I、II、III三类。II类酶识别序列特点为回 文结构。 ··· ··· GGATCC ··· ··· ··· ··· CCTAGG ··· ··· 　 　 限制性核酸内切酶作用后产生两种末端： 　 钝性末端(blunt end) 粘性末端(sticky end) 　 　 　 　 5′-端突出 粘性末端 　 3′-端突出 限制性核酸内切酶识别序列长度为4~8个bp。 不同酶切产生的相同粘性末端称配伍末端（compatible end），可用连接酶连接。 　 　 （三）目的基因 　　应用重组DNA技术所要分离、获得的基因。 1. cDNA(complementary DNA):是指经反转 录合成的，与RNA互补的单链DNA。以单链cDNA为模板，经聚合反应可合成双链cDNA。 2. 基因组DNA（genomic DNA）：是指代 表一个细胞或生物体整套遗传信息（染色体 及线粒体）的所有DNA序列。 　 　 （四）基因载体（vector） 　　能携带目的基因，实现无性繁殖所采用的 可独立复制的完整DNA分子。又称克隆载体。其中为表达出蛋白质设计的载体又称表达载 体。 常用的载体： 质粒、噬菌体DNA、病毒DNA 　 　 载体的选择标准： 能自主复制； 具有两个以上的遗传标记物，便于 重组体的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点）， 常具有多个单一酶切位点，称为多 克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源DNA。 　 　 1.　质粒（plasmid） 　　是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA 分子。大小约为 数 千碱基对。常 有 1 ~ 3个抗药 性 基因，以利于 筛 选。 　 　 　　 　 　 2.噬菌体（phage）DNA 　　 λ 噬菌体DNA改造系统 λ gt 系列（插入型，适用cDNA克隆） EMBL系列（置换型，适用基因组克隆） M13噬菌体DNA改造系统（含lac Z基因） 　 M13mp系列 　 pUC系列 　 　 3.　其他 　　柯斯质粒（cosmid） 酵母人工染色体载体 （yeast artificial chromosome, YAC） 细菌人工染色体 （bacterial artificial chromosome, BAC） 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒、腺病毒相关病毒、逆转录 病毒） 　 　二、重组DNA技术基本原理 　　 1、目的基因的获取 2、基因载体的选择与构建 3、目的基因与载体的拼接 4、重组DNA分子导入受体细胞 5、筛选并无性繁殖含重组分子 的受体分子（转化子） 　 　 （一）目的基因的获取 　　1.　化学合成法 　用于已知序列，或可推导出序列的基因 2.　基因组DNA 　基因组DNA文库（genomic DNA library） 3.　cDNA 　cDNA文库（cDNA library） 4.　聚合酶链反应（polymerase cha