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* * Genes mRNAs Proteins Loss-of-Function Phenotypes Tools for Functional Analysis ? Knockouts ? Dominant Negative(显型负 突变 ) ? Antibodies ? Aptamers(寡核苷酸适配子) ? Antisense ? Ribozymes ? siRNAs Demonstration of a casual role of a gene in the initiation,maintenance, or modulation of a phenotype by selective decrease (knockdown) or lack (knockout) of gene function. Gene of Interest Gain of Function Loss of Function 六、基因剔除技术 （一）基因剔除技术的概念 基因剔除（gene knock out）或基因靶向(gene targeting)灭活是将生物体中某一特定的基因功能给破坏，再研究当生物体缺少这个基因在生长发育的过成中会有怎样的改变，或是会好发怎样的疾病。 原理：利用细胞复制分裂时，染色体进行联合互换发生同源重组homologous recombination） Prdx1 gene ES cell 胚胎 杂合子 Prdx+/- 纯合子 Prdx-/- Prdx1+/+: wide type mice(N=34) Prdx1+/-：Prdx1 heteroxygous mice(N=88) Prdx1-/-：Prdx1 knock out mice(N=64) Sourthern blot-DNA Nothern blot-RNA Generation of Prdx1-/- mice 进入多重防护的SPF动物室 检查受精母鼠 取胚 胚显微注射 DNA显微注射 显微注射完成 胚植入输卵管 养殖小鼠 动物饲养 （二）基因剔除技术的应用 ★ 阐明特定基因功能、基因间相互作用 ★ 阐明基因结构与功能异常在疾病发生、演进和归转中的作用，即疾病分子调控机制 ★ 在精确的时间、组织打开或关闭特定基因 ★ 可对基因进行单个碱基或大片段的修饰 ★ 确定药物作用的分子靶点，有效筛选新药 Model Organisms Used in Functional Genomics Major Events in the Development of Gene Targeting 骨保护蛋白 (Osteoprotegerin, OPG) +/+ -/- 转基因鼠 基因剔除鼠 骨硬化 骨质疏松症 Procedure of Knockout Mice 七、RNA干扰技术 （一）RNA干扰技术的概念 生物体内，双链RNA(double-stranded RNA， dsRNA)，能识别含有其互补序列的mRNA并与之结合，在酶的作用下降解mRNA，从而干扰相应基因表达。这一现象称为RNA干扰(RNA interference，RNAi)。 RNAi在生物抵御病毒感染、维持基因组中转座子的稳定以及某些生物生殖细胞的发育过程中都起着重要作用。 （细胞膜） （细胞核） （细胞质） 基因的表达 转录 翻译 （转运RNA） （核糖体RNA） RNAi现象的发现 1995年，康奈尔大学的研究人员Guo和Kemphues尝试用反义RNA去阻断par-1基因的表达以探讨该基因的功能，结果反义RNA的确能够阻断par-1基因的表达，但是奇怪的是，注入正义链RNA作为对照，也同样阻断了该基因的表达。 ? Guo S, Kemphues KJ. par-1, a gene required for establishing polarity in C. elegans embryos, encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed. Cell. 1995;81(4):611-20. Section of Genetics and Development, Cornell University, Ithaca, New York 14853, USA. 基因沉默，即性状不表现 外源导入或者转基因表达反义RNA，抑制rRNA和tRNA的翻译。 Fire等(1998)发现将dsRNA注入线虫体内后可抑制序列同源基因的表达,并证实这种抑制主要作用于
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