PCR的发明_原理及应用.pptVIP

PCR的发明、原理及应用 PCR的发明 DNA双螺旋结构于1953年发现 第一个细胞内用来复制DNA所需的聚合酶于1956年分离成功 自1970年代起，由于发现选择性切割DNA分子的限制性内切酶及接合酶，可将DNA分子加以重组，因此引发了基因工程的开展 PCR的原理 PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： 1.模板DNA的变性：即在高温（93℃左右）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板； 2.模板DNA与引物的退火(复性)：在低温（37～55℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 3.引物的延伸：在TaqDNA聚合酶的最适温度（72℃）下，以dNTP为原料，按碱基配对与半保留复制原理，从引物的5’→3’方向延伸，合成DNA新链。重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。 PCR反应五要素： 即参加PCR反应的五种主要物质：引物、酶、dNTP、模板、和Mg2+。 （一）Mg2+ :终浓度为1.5～2.0mmol/L，其对应dNTP为200 μmol/L，注意Mg2+ 与dNTPs之间的浓度关系，由于dNTP与Taq DNA聚合酶竟争Mg2+ ，当dNTP浓度达到1 mmol/L时会抑制Taq酶的活性。 Mg2+ 能影响反应的特异性和产率。  （二）dNTP：dNTP具有较强酸性，其储存液用NaOH调pH值至7.0～7.5，一般存储浓度为 10mmol/L， 各成份以等当量配制，反应终浓度为20～200μmol/L。高浓度可加速反应，但同时增加错误掺入和实验成本；低浓度可提高精确性，而反应速度会降低。 （三）Taq DNA聚合酶：能耐95℃高温而不失活，其最适pH值为8.3～8.5，最适温度为70～75℃，一般用72℃。能催化以DNA单链为模板，以碱基互补原则为基础，按5’→3’方向逐个将dNTP分子连接到引物的3’端，合成一条与模板DNA互补的新的DNA子链。某种dNTP或Mg2+ 浓度过高,会增加其错配率。用量一般为0.5～5个单位/100μl。 （四）模板：PCR对模板DNA的纯度不要求很高，但应尽量不含有对PCR反应有抑制作用的杂质存在，如蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制剂、能与DNA结合的蛋白质。 模板DNA的量不能太高，否则扩增可能不会成功，在此情况下可适当稀释模板。 （五）引物：引物浓度一般为0.1～0.5μmol/L，浓度过高会引起错配和非特异扩增，浓度过低则得不到产物或产量过低。引物长度一般15～30个碱基，引物过长或过短都会降低特异性。其3’末端一定要与模板DNA配对，末位碱基最好选用A、C、G（因T错配也能引发链的延伸）。 引物G C约占45～55%，碱基应尽量随机分布，避免嘧啶或嘌呤堆积，两引物之间不应有互补链存在，不能与非目的扩增区有同源性。 PCR常见问题 1、模板原因 ① 纯度：含有抑制物 ② 浓度：含量低or太高 2、引物原因 ①引物错误 ②引物设计不好 ③引物合成、纯化不好 3、PCR条件原因 ①退火温度 ②延伸时间 ③循环次数 4、非特异性扩增或拖尾 ①引物特异性差 ②模板和引物浓度过高 ③酶量过多 ④Mg2+浓度偏高 ⑤退火温度偏低 ⑥循环次数过多 PCR的应用 基因、DNA片段的克隆 人工基因构建 DNA序列测定 基因定点突变 基因型（突变）检测 SNP分析，遗传背景分析 生物物种鉴定，系统进化研究 疾病基因检测 / 遗传病的产前诊断 致病病原体的检测 肿瘤治疗中癌基因的检测 DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别、法医物证 其他: 动、植物检疫（转基因动植物检测） PCR技术 巢式PCR和半巢式PCR (nested primer PCR) 多重PCR (multiple PCR) 不对称PCR (asymmetric PCR) 锚定PCR （anchored PCR) 反向PCR（inverted PCR) 彩色PCR （color complementation asay) 原位PCR（in situ PCR） 差异显示PCR（differential display PCR） 重组PCR（recombinant PCR） 增敏PCR 定量PCR（quantified PCR） 荧光实时定量PCR技术 * * Kary B. Mullis ，在Cetus公司工作期间，发明了PCR。 他原本是要合成DNA引