ape1在大鼠耳蜗血管纹边缘细胞拟老化伴mtdna4834缺失突变细胞模型中的作用及其机制的分析word格式论文.docxVIP

英文缩略词表英文缩写英文全称中文对照CDCommon deletion普遍缺失AHLAge-related hearingloss老年性耳聋bpBasepair碱基对mtDNAMitochondrial DNA线粒体DNAAPE1apurinic/apyrimidimic endonuclase/redoxfactor1无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子-1D-galD-galactoseD-半乳糖MCsMarginal cells边缘细胞SA-β-galsenescenceassociated β-galactosidase衰老相关的β-半乳糖苷酶EpiCM-aEpithelial Cell Medium-animal上皮细胞培养基(动物)ROSreaction oxygen species活性氧簇中文摘要【目的】探讨APE1 在大鼠耳蜗血管纹边缘细胞拟老化伴mtDNA4834 缺失突变细胞模型中的作用，为老年性聋的预防和治疗提供新的目标。【方法】（1）取用SD大鼠乳鼠(3日龄)耳蜗血管纹组织，原代培养和鉴定血管纹边缘细胞（MCs）。采用12mg/mlD-半乳糖作用MCs120hr，构建MCs拟老化伴mtDNA4834缺失突变（CD）细胞模型。（2）用免疫荧光的方法在激光共聚焦显微镜下观察APE1 蛋白在MCs中的表达及分布。用MCs感染预实验来筛选感染MCs 的适宜的重组腺病毒滴度。（3）将离体MCs 按照以下处理方式分为四个组：1）C 组，对照组，普通培养基培养，不作处理；2）D组，D-gal组，培养基中加入12mg/mlD-半乳糖继续培养120hr3）K组，空载病毒+ D-gal 组，转染Ad-GPF腺病毒4hr后，改用12mg/mlD-半乳糖培养120hr；4）A组，APE1+D-gal 组，转染Ad-APE1-GPF重组腺病毒4hr后，改用12mg/mlD-gal 继续培养120hr。（4）运用real time-PCR，检测以上四组中CD突变率。运用Western blot，检测四组APE1蛋白的表达。运用β-半乳糖苷酶染色，检测各组细胞的衰老情况。运用流式细胞术，来检测各组细胞的凋亡情况。【结果】（1）在MCs 中，APE1 主要表达于细胞质。（2）关于四组的CD 突变率，发现D组和K组分别与C 组相比较，其缺失率增高，有显著统计学意义，而A组对比K组，缺失率有明显降低。（3）关于四组中APE1 蛋白的表达水平，与C 组相比较，D组和K 组中APE1 的蛋白表达水平均升高。对比K组，A组中APE1 蛋白水平有统计学意义上的增高。（4）关于衰老染色结果和凋亡检测结果显示，D组和K组分别与C 相比较，阳性表达的细胞增多，有统计学意义；对比K组，A组中阳性表现细胞明显减少，有统计学意义。【结论】发现APE1蛋白在MCs 中有明显的表达，并且主要分布在细胞质中。通过腺病毒转染而过表达APE1在MCs拟老化模型中可能发挥了一定的保护效应，减少了MCs 因D-半乳糖诱导产生的CD突变率，并且可以在一定程度上缓解由D-半乳糖诱导的MCs 的老化和凋亡。【关键词】血管纹边缘细胞；拟老化模型；mtDNA4834缺失突变；APE1；腺病毒转染；衰老；老年性聋Abstract【Objective】To investigatethe expression and effect ofAPE1 in D-galinduced stria vascularisMCsofratagingmodelharboringCD,tofindanewgoalforthetreatment ofAHL.【Methods】NeonatalSDrats’cochlearstriavasculariswasusedtoprimarycultureMCs,then add12mg/mlD-galinthemediumfor120hrtoinducetheCD,creatinganMC senescencemodel.TheexpressofAPE1wastestedbyimmunofluorescence.WeusetheMCs infection preteststo screen thesuitable infection titerof adenovirus.Nowthe cells weredivided into fourgroups:group C: Control group, culturewithoutanytreatment.group D: D-gal group,to added 12mg/mlD-gal to the medium and cultured for 120hr.groupK:firsttransfectedtheMC