apobec3f和3g与乙肝核心抗原的相互作用及其在细胞中定位研究word格式论文.docxVIP

优秀毕业论文 精品参考文献资料 学位论文原创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的工作研究及取得的研究成果。论文 中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或 撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在论文中以 明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。 作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文使用授权声明 本人授权汕头大学保存本学位论文的电子和纸质文档，允许论文被查阅和 借阅。学校可将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或其它复制手段保存和汇编论文。学校可以向国家有关部 门或机构送交论文并授权其保存、借阅或上网公布本学位论文的全部或部分 内容。对于保密的论文，按照保密的有关规定和程序处理。 本论文属于：保密（ ），在 年解密后适用本授权声明。 不保密（ ）。 （请在以上括号内打“√”） 作者签名： 导师签名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日 汕头大学医学院硕士学位论文 汕头大学医学院硕士学位论文 I I 中文摘要 研究目的和意义 载 脂 蛋 白 B mRNA 编 辑 酶 催 化 多 肽 (apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic-polypeptide，APOBEC)家族，是近年来发现的具有抗病毒作用的天然免疫分子， 可通过 DNA 编辑、RNA 编辑以及非编辑途径对 HIV 和 HBV 等多种病毒进行抑制。其 中 A3F 和 A3G 可通过多种途径抑制 HBV 的复制，其通过与 HBcAg 的相互作用，抑制 HBV 前体 RNA 的包装，通过非编辑途径发挥病毒抑制功能；亦可通过编辑途径对 HBV 基因组超突变。但目前尚有一些机制仍不明确，A3F 和 A3G 与 HBcAg 的相互作用是直 接的蛋白结合还是经细胞内其它蛋白介导结合；A3F 和 A3G 的亚细胞定位与其不同途径 抑制病毒复制的功能之间的联系等。为此，本研究通过对 A3F 和 A3G 进行克隆、表达、 亚细胞定位分析以及与乙肝核心抗原相互作用进行研究，以期揭示 A3F 和 A3G 抑制 HBV 的部分待解决的疑问。 材料和方法 1. 提取经 PHA 刺激的人外周血单个核细胞的 RNA，RT-PCR 克隆人 A3F 和 A3G 的 cDNA， 并构建其酵母双杂交表达载体 pGADT7-3G/-3F；PCR 克隆 HBV ayw 亚型核心抗原 HBcAg 基因，构建其酵母双杂交表达载体 pGBKT7-HBcAg。 2. 排除自激活效应后，将构建的载体 pGBKT7-HBcAg 分别与 pGADT7-3G 和 pGADT7-3F 共转化到 AH109 酵母菌，利用营养二缺平板及四缺平板培养、α-半乳糖苷酶活性测试， 检测 HBcAg 与 A3F 和 A3G 的直接相互作用。 3. 构建含有 HBcAg、人 A3F 和 A3G 基因的多种标签融合真核表达载体，脂质体法转染 HeLa 细胞进行免疫共沉淀实验和免疫共沉淀回收产物的 Western blotting 检测。 4. 人 A3F 和 A3G 的真核表达载体转染 MDCK 细胞，间接免疫荧光检测人 A3F 和 A3G 的亚细胞定位。 5. 构建含有核定位信号的绿色荧光蛋白表达载体，转染 MDCK 细胞，观察核定位信号的 定位功能；并将人 A3F 和 A3G 与上述经功能验证具有核定位功能的核定位信号融合 表达，免疫荧光观察人 A3F 和 A3G 是否发生转位。 II II 结果及结论 1. 酶切及 DNA 测序分析表明成功克隆 HBcAg、人 A3F 和 A3G，并成功构建酵母双杂 交、免疫共沉淀、真核表达及亚细胞定位相关的表达质粒。 2. 通过酵母双杂交实验对α-半乳糖苷酶定性和定量检测显示， A3F 和 A3G 蛋白均与 HBcAg 蛋白可能不存在相互作用亦或是并不发生直接的相互作用，而是可能通过某 个蛋白的介导而发生间接相互作用。 3. 将构建好的 pcFlag-3F、pcFlag -3G、pcMyc-HBcAg 质粒分别进行转染 HeLa 细胞 48hr 后通过 Western blot 显示 A3F 和 A3G 蛋白和 HBcAg 蛋白在 HeLa 细胞中均能很好表 达；进一步将转染 48hr 后的 HeLa 细胞裂解产物进行 Co-IP 实验显示 A3F/A3G 蛋白 和 HBcAg 蛋白均能被沉淀下来，而蛋白量有所下降。 4. 在荧光显微镜下观察显示 A3F 和 A3G 重组蛋白呈密集点状主要分布在细胞胞浆，而 胞核位置无明显荧光信号。表明 A3F 和 A3G 蛋白主要定位于细胞胞浆。 5. 荧光观察显示转染 pEGFP-C1 对照载体的