cpn0810基因克隆与表达及诱导thp1细胞产生前炎症细胞因子和凋亡的研究word格式论文.docxVIP

目录一、主要缩略语英文索引 1二、中文摘要 3三、英文摘要 5四、正文 8前言 8实验材料 11实验方法 13实验结果 24讨论 35结论 39五、参考文献 40六、附录 44七、文献综述 46八、成果目录 54九、致谢 55主要缩略语英文索引缩略语BCA全称bicinchoninic acid中 文 名 称二辛宁可酸bp BSA DEPCDNABase pair Albumin,Bovine Serum diethyl-pryocarbonatedeoxyribonucleic acid碱基对牛血清白蛋白 焦碳酸二乙酯 脱氧核糖核酸dNTP DMEM DMSO DTT EB ECL EDTAELISADeoxyn deoside triphosphate dulbecco′s modified eagle medium dimethyl slfoxideDithioth eitol Ethidium bromideenhanced chemiluminescence Ethylene diamietetraacetic acidEnzyme linked immunosorbent assay脱氧三磷酸核苷酸达尔伯氏改良培养基二甲基亚砜 二硫苏糖醇 溴化乙锭 增强化学发光 乙二胺四乙酸 酶联免疫吸附试验FITCHis HRP IPTG mRNA Ni-NTA ODfluorescein isothiocynate Histidinehorseradish peroxidaseIsopropβ-D-thiogalactopyranoside messenger RNAnickel nitrilotriacetic acidoptical density异硫氰酸荧光素组氨酸 辣根过氧化物酶异丙基-β-D-硫代半乳糖信使 RNA镍-亚硝胺乙酸光密度PBS PCR RNASDSPhosophate buffered saline Polymerase chain reaction ribonucleic acidSodium Dodecyl Sulphate磷酸盐缓冲液聚合酶链反应核糖核酸 十二烷基硫酸钠SDSSDS-polyacrylamide gel eletrophroresisSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 TBSTris-buffered SalineTris 缓冲盐溶液TETris/EDTA bufferTris/EDTA 缓冲液TEMEDTrisN,N, N′N′ -tetramethylethylenediamineTris-(Hydroxymethyl) aminomethaneN,N,N′N′-四甲基乙胺三羟甲基氨基甲烷Cpn0810 基因克隆与表达及诱导 THP-1 细胞产生前炎症细胞因子和凋亡的研究硕士研究生：陈玉玉导师：吴移谋 教授中文摘要目的：构建重组质粒 pGEX6p-2/Cpn0810，在 E.coli BL21 中进行诱导表达， 纯化获得重组融合蛋白 Cpn0810。研究该重组蛋白在体外诱导人单核细胞产生前 炎症细胞因子 TNF-α 和 IL-6 的水平及诱导细胞凋亡的作用，为进一步探索 Cpn 感染致病的分子机制提供实验依据。方法：PCR 扩增 Cpn0810 蛋白编码基因，构建 pGEX6p-2/Cpn0810 重组质粒， 测序正确后在 E.coli BL21 中诱导表达，用 SDS和 Western-Blot 进行分 析和鉴定。用 ToxinEraser 纯化柱去除内毒素后用不同浓度的 GST-Cpn 0810 刺 激 THP-1 细胞；ELISA 法检测经刺激后的 THP-1 细胞产生的 TNF-α 和 IL-6 水平； 以 WST-1 法检测经 GST-Cpn0810 处理后对 THP-1 细胞的增生或抑制作用；用 Hoechst33258 荧光染色、AnnexinV-FITC-PI 染色法检测细胞凋亡情况。结果：构建了重组质粒 pGEX6p-2/ Cpn0810，并在 E.coli BL21 菌中高效表达 出 Mr 约为 42kDa 的 GST-Cpn 0810 目的蛋白，超声裂解后 SDS分析目的 蛋白在菌体细胞内以可溶性形式表达，经采用默克 Novagen 的 GST 纯化树脂纯 化获得纯度在 95%以上的重组蛋白。GST-Cpn 0810 能诱导 THP-1 细胞表达 TNF-α 和 IL-6，并以时间、剂量依赖方式刺激细胞分泌前炎症细胞因子 TNF-α 和 IL-6， 当 GST- Cpn0810 的浓度为 4μg/mL 时产生的 TNF-α 和 IL-6 量最多，分别为（184.75±17.40）pg/mL、（75.36±29.49）pg/mL；当 GST-Cpn 0810 刺激