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优秀毕业论文 精品参考文献资料 CTX-M-3 型超广谱β-内酰胺酶的原核表达和纯化 硕士研究生：李翊泉 指导老师：廖伟娇教授 摘要 目的：对肺炎克雷伯菌所产 CTX- M- 3 型超广谱β - 内酰胺酶 （ext ended- spect r um β- l act amase ，ESBLs）进行基因重组表达及纯化。 方法：对保存重组细菌 DH5α/ pGEM- T- CTX- M- 3 菌种鉴定和超广谱β- 内酰胺 酶确证后，对其所产的 CTX- M- 3 型酶基因进行序列分析，明确酶基因表型。构建 原核表达载体 pET- 28a( +) 与 CTX- M- 3 编码基因的重组体，并在大肠杆菌 BL21 （DE3）中原核表达。I PTG 诱导 CTX- M- 3 融合蛋白表达，表达产物经过亲和层析 纯化，用 SDS- PAGE 电泳和免疫印迹法( West er n- bl ot ) 鉴定该纯化蛋白。 结果： （1）pGEM- T- CTX- M- 3 重组菌质粒经 NdeI 和 EcoRI 酶切后获得的片段大小约 为 876 bp 和 3000 bp。核苷酸序列分析结果显示，目的基因片段大小为 876 bp， 经 GenBank 同源性比较，与 GenBank 上登录的 CTX- M- 3 100%符合。 （2）成功构建 pET- 28a( +)- CTX- M- 3 重组质粒，经 NdeI 和 EcoRI 双酶切后， 获得大小约为 876 bp 和 5000 bp 的片段，与预期大小相符，证明目的基因已经 成功插入 pET- 28a( +) 载体中。 （3） 可溶性检测表明表达产物以可溶性形式( 上清中) 和包涵体形式( 沉淀中) 两种形式存在。通过蛋白表达条件的优化实验，SDS- PAGE 电泳结果显示 18℃、 0. 8mmol / L I PTG 诱导 24h 的 CTX- M- 3 重组蛋白的可溶性表达最佳。 （4）利用镍琼脂糖凝胶亲和柱层析对重组蛋白进行了初步的纯化研究。 SDS- PAGE 电泳和 West er n- bl ot 检测表明我们获得纯化的重组 32kD 蛋白。 结论：本研究成功构建了pET- 28a( +)- CTX- M- 3基因的原核表达载体，并在大 肠杆菌中BL21表达，用His亲和层析柱纯化表达产物，并获得高纯度可溶性的重 组蛋白。纯化蛋白为进一步酶生物学特性及酶的抗体制备研究奠定了基础。 关键词：超广谱β- 内酰胺酶 CTX- M- 3 原核表达 纯化  Prokaryotic expression and purification of CTX-M-3 extended-spectrum β-lactamase. Postgraduate: Yiquan li Supervisor: Prof.Weijiao Liao Abstract Objective： To carry out prokaryotic expression and purification of CTX-M-3 extended-spectrum β-lactamase (ESBLs)from Klebsiella pneumoniae. Method: The sequence of CTX-M-3 Extended Spectrum β-Lactamase (ESBL)encoding gene wsa analysised from the preserved recombinant DH5α/pGEM-T-CTX-M-3. Recombinant plasmid(pET-28a(+)-CTX-M-3)were identified by restriction enzymes digestion,then transformed into E.coli strain BL21(DE3).Expression of CTX-M-3 fusion protein induced by IPTG，and then purified with Ni-NTA. The purification protein were identified by SDSand Western-blot. Results: (1) The recombinant plasmids pGEM-T-CTX-M-3 is digested by NdeI and EcoRI and yields fragments. The size of the fragments were proximate 876 bp and 3000 bp.